非培養(yǎng)法檢測肝硬化患者腹水真菌的實(shí)驗(yàn)研究

吳浩，蘭蘭

(武寧縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 武寧332300)

肝硬化并發(fā)感染在臨床上十分常見，而真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢。由于肝硬化腹水患者庫普弗細(xì)胞(Kupffer cell)數(shù)量明顯減少，導(dǎo)致其不能發(fā)揮吞噬過濾作用[1]。同時(shí)血漿補(bǔ)體和調(diào)理素水平降低，低白蛋白血癥，中性粒細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性降低，使中性粒細(xì)胞防御感染能力削弱[2]。另外，由于肝硬化時(shí)腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡被打破，腸道真菌數(shù)量和種類都可能發(fā)生改變，患者免疫防御系統(tǒng)遭破壞，念珠菌等腸道定植真菌很可能成為人體黏膜和侵襲性真菌感染的條件致病菌[3]。

目前國內(nèi)外更多關(guān)注肝硬化患者腹腔的細(xì)菌感染，而研究真菌感染方面較少。本文以分子生物學(xué)為研究方法，根據(jù)真菌18S rRNA基因兼有保守性和變異性的特點(diǎn)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)一對通用引物，通過PCR方法結(jié)合克隆測序法，檢測肝硬化患者腹水中真菌感染情況。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 收集2010年3月至2011年3月我院158例肝硬化患者的腹水標(biāo)本，每份腹水標(biāo)本收集1次，男127例，女31例，年齡21~79歲，平均年齡(54.7±13.0)歲。肝硬化診斷符合2000年9月西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。取受試者腹水，接種在沙保氏培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3~7d，通過形態(tài)學(xué)檢測結(jié)合法國生物梅里埃公司的Vitek YBC卡鑒定菌種。同時(shí)收集腹水分裝于2 ml進(jìn)口高壓滅菌的 Eppendorf管中。所有標(biāo)本均在1 h內(nèi)處理完畢，并置于-80℃冰箱中待抽提 DNA[5]。

1.2 對照菌株 陽性對照真菌：白色念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新型隱球菌、曲霉菌。陰性對照菌細(xì)菌：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌。 以上菌株由檢驗(yàn)科微生物室提供。

1.3 DNA提取 對照菌株取3~5個(gè)菌落于200μl生理鹽水中，其余步驟參照QIAampRDNA mini kit說明書，提取總DNA。

1.4 引物特異性檢測 用真菌18S rDNA通用引物(5＇-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3＇)和(5＇-GATCCCTAGTCGGCATAGTT-3＇)[6，7]，PCR 擴(kuò)增 8 種真菌對照菌株，2種細(xì)菌對照菌株DNA。擴(kuò)增體系為25μl：10×Buffer(含 MgCl2)2.5μl，dNTP(各 2.5mmol/L)2.5μl,引物(10μmol/L)0.6μl，Taq 酶(5U/μl)0.2μl，模板 DNA2μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4min，94℃變性 45s，52℃退火45s，72℃延伸 2min， 循環(huán) 38次，72℃ 7min完成擴(kuò)增，取5μl PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析處理，以檢測引物特異性。

1.5 PCR擴(kuò)增真菌18S rDNA 采用上述引物、擴(kuò)增體系、擴(kuò)增條件對病人腹水中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖電泳后，凝膠圖像分析儀攝像。

1.6 真菌18S r DNA基因克隆、測序及同源性分析將PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy vector連接，轉(zhuǎn)化至DH50α 宿主細(xì)胞中。 使用含 16μl 20%IPTG、40μl l2%X-gal和1%氨芐西林的選擇性LB瓊脂平板篩選含重組質(zhì)粒的白色克隆子，將白色克隆子點(diǎn)種兩點(diǎn)于LB平板上，取一點(diǎn)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR條件同上。對驗(yàn)證陽性的克隆子，取另一點(diǎn)經(jīng)LB培養(yǎng)液培養(yǎng)后，進(jìn)行測序。測得的DNA序列通過BLAST軟件進(jìn)行DNA序列相似性分析。

2 結(jié)果

2.1 對照菌株18S rDNA擴(kuò)增結(jié)果 7種對照真菌菌株用真菌通用引物擴(kuò)增在1000bp左右都有一條條帶，而3種對照細(xì)菌菌株未能擴(kuò)出相應(yīng)條帶，說明該引物擴(kuò)增真菌18S rDNA具有很好的特異性，見圖1。

圖1 對照菌株18SrDNA擴(kuò)增結(jié)果

2.2 受試者腹水DNA擴(kuò)增、克隆、測序及BLAST結(jié)果 有11份腹水標(biāo)本真菌18S rDNA擴(kuò)增陽性，經(jīng)克隆、測序后，測序結(jié)果用BLAST軟件在NCBI GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，其中未能培養(yǎng)真菌(uncultured fungus)最多，占43.8%，念珠菌屬(Candida spp.)占 9.4%,酵母菌屬(Saccharomyces spp.)占3.1%，此外還有雙足囊菌、馬拉色菌、裸菇菌以及其他少見真菌等。

2.3 培養(yǎng)法與分子生物學(xué)法比較 有2份腹水標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽性，分別為S25—地絲菌和S26—近平滑念珠菌。PCR擴(kuò)增18S rDNA,S25和S26均可在1000bp左右出現(xiàn)一條條帶，經(jīng)克隆、測序、BLAST比對后S25為雙足囊菌，即頭狀地霉，而該菌屬于地絲菌屬，與培養(yǎng)結(jié)果一致。S26檢測出近平滑念珠菌。

3 討論

真菌廣泛分布于自然界，在人體皮膚、黏膜、糞便中常可檢測到，亦是腸道正常菌群。在維持腸道微生態(tài)中起著重要作用，通常并不致病。近年來，臨床深部真菌感染增多且復(fù)雜，在國內(nèi)外多有報(bào)道[8，9]。肝硬化病人因免疫力降低、長期服用廣譜抗生素等 原因，致使體內(nèi)微生態(tài)失衡，外源性真菌乘虛而入或內(nèi)源性常駐真菌大量繁殖而致病。另外，腸道屏障的結(jié)構(gòu)和功能改變引起腸道通透性增加，有利于腸腔內(nèi)真菌易位到腸腔以外部位并引起侵襲性感染，腸道為系統(tǒng)性真菌病發(fā)生的源頭[3]。

培養(yǎng)法是臨床上檢測真菌的主要方法，廣泛應(yīng)用于各臨床實(shí)驗(yàn)室。其主要依據(jù)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)等表型特征對真菌進(jìn)行鑒定，往往費(fèi)時(shí)且陽性率低[10]。由于技術(shù)的限制，目前能被分離培養(yǎng)而為人類了解的微生物僅是世界上微生物資源中極少的一部分，僅有5%的真菌能被分離培養(yǎng)和檢測到[11。因此，建立一種檢測真菌感染快速而準(zhǔn)確的方法十分必要。

為了克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性 ,分子生物學(xué)方法被用于真菌生態(tài)研究。據(jù)最新研究報(bào)道，18S rDNA和ITS的限制性片段分析是真菌群落分析和種類鑒定的快速有效方法[12]。18S rDNA序列包含保守區(qū)域和可變區(qū)域，普遍存在于真菌基因組中，是真菌多態(tài)性研究廣泛采用的靶序列[13]。本文通過設(shè)計(jì)真菌18S rDNA通用引物,擴(kuò)增真菌的18S rDNA,通過克隆測序鑒定真菌的種類。本研究證實(shí)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法比較，在培養(yǎng)陽性的兩例腹水標(biāo)本，PCR法同樣檢出了相應(yīng)條帶，并通過克隆測序，證實(shí)分子生物學(xué)法檢出的真菌種類與培養(yǎng)法相符。另外，該方法還能檢測到未能培養(yǎng)的真菌及其他一些培養(yǎng)無法鑒別的真菌，陽性率更高。因此，真菌通用引物擴(kuò)增真菌DNA具有高度特異性、敏感性,且用分子生物學(xué)法可檢出一些培養(yǎng)法無法培養(yǎng)的真菌。

本研究課題在158例肝硬化患者腹水中發(fā)現(xiàn)11例真菌DNA陽性，而對于腹水中真菌從何而來，目前還不得而知。很多研究表明了實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用PCR診斷傳染病的有效性和實(shí)用性。目前，應(yīng)用PCR法檢測肝硬化患者腹水中細(xì)菌DNA，已成為研究肝硬化患者腸道細(xì)菌易位的一種新方法，腹水中細(xì)菌DNA陽性可作為肝硬化患者腸道細(xì)菌易位至腹水的分子證據(jù)[14]。也許，應(yīng)用分子生物學(xué)方法將為研究肝硬化病人腹水真菌來源提供新的方法和思路。

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