人血管內皮生長因子的生物信息學分析

梁 丕（廣東省信宜人民醫院心內科，廣東 信宜 525300）

血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），又稱血管通透因子（Vascular permeability factor，VPF）或血管調理素（Vasculotropin），是1989年Ferrara等從牛垂體濾泡星狀細胞培養液中分離純化的糖類蛋白質，后來在鼠垂體前葉腫瘤細胞系、鼠神經膠質瘤細胞、豚鼠瘤、人單核細胞等細胞培養液中也純化出了VEGF蛋白[1]。VEGF是一個具有高度保守性，由兩個相同亞基（Mr 23 000）以二硫鍵交聯結合成的二聚體糖蛋白，主要作用于血管內皮細胞[2-3]。VEGF由某些腫瘤細胞分泌，通過與血管內皮上的相應受體結合促進內皮細胞增殖，同時可增加血管通透性使內皮細胞遷移，誘導腫瘤血管生成，維持腫瘤的繼續生長，是目前發現的最強烈的血管生成因子，與腫瘤及非腫瘤的血管新生病理過程中密切相關，其與轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、NO及一些重金屬離子有關，還受缺血和缺氧環境的調節[4]。目前VEGF基因已先后從人、野豬、綿羊等多種動物中克隆出來，并通過分子遺傳學方法證明了該基因在血管生成、重構、病變等過程中的重要作用，因此對VEGF的研究成為當前的熱點課題。本文利用生物信息學工具和方法，以人VEGF分析為重點，對動物VEGF的核苷酸和氨基酸序列的特征，及其編碼蛋白的理化性質、分子結構、生化功能和系統演化等進行預測分析，以期為深入探討VEGF蛋白的酶學特性和血管生成的分子機制提供理論依據。

1 臨床資料

VEGF的核苷酸和氨基酸序列來源于NCBI數據庫，其中人VEGF的登錄號依次為：GenBank Accession No.AY047581，GenPept accession no.AAK95847。

利用Vector NTI Suit 8、Clustal X、MEGA4.1β、Accelrys ViewerLite 5.0軟件和www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.org等網站提供的各種在線生物信息學工具進行預測和分析。核酸及氨基酸序列的分子結構和理化性質分析、開放閱讀框的查找和翻譯使用Vector NTI Suit 8和Protparam軟件完成；核酸及氨基酸序列的同源性比對使用Clustal X軟件和NCBI上的Blast在線工具進行；分子系統發生樹使用MEGA3的Phylogeny中的Neighbor-Joining方法構建；蛋白質的功能結構域和三級建模分別用CDD和SWISSMODEL分析。

2 結果

2.1 人VEGF基因的核酸及其編碼蛋白的序列特征和理化性質：NCBI上登錄的人VEGF核苷酸序列全長640 bp，包括3'-UTR（Untranslated Regions，非翻譯區）、ORF（Open Reading Frame，開放閱讀框）和5'-UTR序列，且編碼區的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。用Protparam預測VEGF編碼蛋白的理化性質，推測該蛋白的分子式為C960H1504N288O281S23，分子量為22.3136 kDa，等電點pI=7.88，摩爾消光系數為24 950，半衰期為30 h，脂肪酸系數60.73，總的親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為－0.704，推論該蛋白屬于疏水性蛋白，而不穩定參數為56.69，故屬不穩定蛋白。該基因相應的氨基酸殘基數為191，所含氨基酸組成見表1，含Cys和Glu最多，不含Pyl和Sec。

表1 人VEGF蛋白的氨基酸組成

2.2 人VEGF蛋白的氨基酸序列的比對分析：選取人等7條動物VEGF氨基酸序列，在Vector NTI 8軟件中進行多重比對分析。分析結果用不同顏色顯示，見圖1，顏色越深的表示同源性越高，最深的區域則表示可能存在的重要功能域。分析結果顯示動物VEGF具有很高的同源性，一致性達到43.5%，可見VEGF編碼區高度保守。而其中僅原雞的變異性較大，則提示禽類與哺乳動物的VEGF之間存在差異，這一方面說明VEGF在物種進化過程具有重要意義，另一方面也推測這可能是由于動物血管生成的機制存在很強的相似性，而作為與血管發生密切相關的VEGF蛋白必須保持足夠的遺傳穩定性和演化趨同性。

圖1 來自不同動物VEGF氨基酸序列多重比對

2.3 人VEGF蛋白的氨基酸序列的分子系統進化樹分析：將7條動物VEGF蛋白氨基酸序列在Clustal X軟件中進行完全比對后，在MEGA4.1軟件中依據NJ（Neighbor-Joining）方案進行構建分子進化樹[5-6]。獲得VEGF氨基酸序列的分子進化樹分析結果見圖2。7種動物的VEGF氨基酸序列聚成4支：人與野豬聚成第一支；綿羊和藏羚羊聚成第二支；鼴鼠和小鼠聚成第三支，而原雞則獨立一支。該進化樹很好地反映出了這7種不同動物之間的親緣關系，如人與豬同屬較高等的哺乳動物，聚為一支，綿羊與藏羚羊同屬羊亞科也聚為一支，鼴鼠和小鼠為鼠總科的嚙齒類動物，原雞則因其屬非哺乳的禽類而單獨成支。由此可見，依據氨基酸序列構建的分子進化樹能在一定程度上反映不同動物之間的系統分類學關系和自然演化進程，其結果對于明確判斷物種間的親緣關系能提供一定的參考。

圖2 基于MEGA4.1中NJ方法的人和其他物種的VEGF分子進化樹聚類分析

2.4 人VEGF編碼蛋白的功能結構域和三維建模分析：蛋白質由多個基序組成，且基序相應的氨基酸區段行使特異的生化功能，同時也蘊含著各自的遺傳進化信息。利用CDD在線工具分析人VEGF氨基酸序列的功能結構域，即去掉信號肽，剩下的成熟肽氨基酸序列包含一個PDGF超家族功能域，見圖3[7]。表明人VEGF編碼蛋白屬于血小板衍生因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）超家族，同樣屬于一種重要的促有絲分裂因子，具有刺激特定細胞群分裂增殖的能力，在血管生成和重構機制中具有關鍵作用。將這條人VEGF氨基酸序列上傳至SWISS-MODEL服務器中進行基于同源性的三維建模，然后在ViewerLite 4.2軟件中進行序列編輯，獲得人VEGF的三級結構模型，見圖4[8-9]。

圖3 人VEGF的保守結構域分析

圖4 人VEGF基因編碼蛋白的三維結構預測

3 討論

VEGF作為血管生成和重構的關鍵因子而倍受關注，依托于生物學實驗數據與現代計算技術相結合的生物信息學已經成為后基因組時代的重要方法和前沿領域[10]。本文應用生物信息學方法對人VEGF基因的核苷酸及其編碼蛋白質序列進行了比對、分析和建模，進而對其分子結構和生化功能進行了預測分析，結果表明該基因的核苷酸序列包括3'-UTR、ORF和5'-UTR，推測其編碼蛋白分子式為C960H1504N288O281S23，是含有PDGF重要功能域親水性不穩定蛋白質，其在動物系統進化過程中可能具有重要作用，且三維結構建模成功。本研究結果可為深入開展人VEGF蛋白的生化特性和血管生成的分子機制研究提供重要理論參考，有利于推動桑等腫瘤學和心血管病學的發展。

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