胃癌組織VEGF表達(dá)及血清VEGF濃度與DCs浸潤(rùn)及其活性的關(guān)聯(lián)分析①

肖煒明 吳克艷 龔衛(wèi)娟 丁巖冰 王 艷 卜 平

(揚(yáng)州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，揚(yáng)州225001)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為是一種重要的促腫瘤生長(zhǎng)因子。其不僅通過旁分泌途徑刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，誘導(dǎo)血管形成而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);還具有增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)，有利于腫瘤基質(zhì)形成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的活性［1，2］。另外，VEGF 還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過降低體內(nèi)免疫監(jiān)視功能而促進(jìn)免疫逃逸［3，4］。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，具有很強(qiáng)的攝取、加工、遞呈抗原的能力，從而激發(fā)抗原特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，既往研究也已經(jīng)證實(shí)DCs的浸潤(rùn)及其功能與胃癌的預(yù)后、TNM 分期等密切相關(guān)［5，6］。因此，本文試圖觀察胃癌組織VEGF表達(dá)強(qiáng)度、血清VEGF濃度分別與胃癌組織內(nèi)DCs浸潤(rùn)密度的關(guān)系，胃癌組織內(nèi)VEGF陽(yáng)性DCs浸潤(rùn)頻率與胃癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)聯(lián);胃癌患者與健康個(gè)體外周血單核來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達(dá)，從而深入揭示VEGF調(diào)節(jié)DCs活性參與胃癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 臨床資料 收集2009年4月至2012年7月經(jīng)我院外科手術(shù)，病理證實(shí)為胃癌的組織標(biāo)本142例，其中男性101例，女性41例，平均年齡(61．94±10．23)歲。所有入選病例均無長(zhǎng)期使用非甾體消炎藥和糖皮質(zhì)激素類藥，術(shù)前均未接受過放療或化療。腫瘤組織學(xué)類型按WHO分級(jí)，高中分化腺癌76例，低/未分化腺癌66例;腫瘤大小:＜5 cm者81例，≥5 cm者61例;發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者97例，無局部淋巴轉(zhuǎn)移者45例;未侵及漿膜層者60例，侵及漿膜層者82例;根據(jù)2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的第7版胃癌TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期/Ⅱ期74例，Ⅲ期/Ⅳ 期68例。隨機(jī)選取37例癌旁組織作為對(duì)照組，并經(jīng)過病理檢查排除累及腫瘤。隨機(jī)取20例患者血清，其中男性13例，女性7例，平均年齡(57．90±12．43)歲;健康個(gè)體20例，其中男性 12例，女性 8例，平均年齡(56．91±9．68)歲。隨機(jī)取5例胃癌患者和5例健康個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，經(jīng)體外誘導(dǎo)為DCs。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料 鼠抗人VEGF單克隆抗體(mAb)購(gòu)自Santa Cruz公司;Alex488標(biāo)記的驢抗鼠、羊抗兔抗體購(gòu)自Invitrogen公司;兔抗人CD11c抗體購(gòu)自武漢博士德公司;APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PE-CD86 mAb來自 Biolegend公司;人 VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為公司;DAPI封片劑購(gòu)自 VECTASHIELD公司;重組人 GM-CSF、IL-4購(gòu)自PeproTech公司;重組人VEGF蛋白(rhVEGF)購(gòu)自R＆D公司;外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自挪威Axis-shield公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫熒光法檢測(cè)腫瘤組織 VEGF表達(dá)及DCs密度 腫瘤組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚4 μm。石蠟切片脫蠟后，梯度酒精水化，95～99℃水浴抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，2%驢或山羊血清室溫封閉30分鐘。然后孵育鼠抗人VEGF(1∶50 稀釋)及兔抗人 CD11c(1∶50 稀釋)抗體4℃過夜。PBS洗滌后，同時(shí)孵育驢抗鼠、羊抗兔熒光二抗(1∶1 000稀釋)37℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌，自然晾干后，滴加DAPI封片，熒光顯微鏡觀察。

1．3．2 CD11c陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞形態(tài)完整且不規(guī)則，胞漿有明顯突起，分布在腫瘤細(xì)胞間和(或)腫瘤間質(zhì)內(nèi)。紅色熒光特異地定位于胞膜內(nèi)的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。染色結(jié)果按參考文獻(xiàn)［7］判斷:陰性(－)沒有或僅有少許染色細(xì)胞;陽(yáng)性(+)散在的染色細(xì)胞;陽(yáng)性(++)癌巢多個(gè)染色細(xì)胞;陽(yáng)性(+++)彌散的染色細(xì)胞。

1．3．3 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞形態(tài)完整，胞漿著綠色熒光，染色結(jié)果判斷分別按陽(yáng)性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度計(jì)分［8］。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0，計(jì)0分;1%～10%計(jì)1分;11% ～50%計(jì)2分;51%～75%計(jì)3分;＞75%計(jì)4分。染色陰性計(jì)0分;淡綠色計(jì)1分;綠色計(jì)2分;深綠色計(jì)3分。兩種積分相加，積分為0～2分，表示陰性(－);積分≥3分為陽(yáng)性。其中積分為3分，表示陽(yáng)性(+);積分為4～5分，表示陽(yáng)性(++);積分為6～7分，表示陽(yáng)性(+++)。

1．3．4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清VEGF濃度 按試劑盒提供的操作說明進(jìn)行，主要步驟:加血清至各檢測(cè)孔，室溫孵育2小時(shí);洗板3次，加檢測(cè)抗體;混勻后蓋上封板膜，室溫孵育2小時(shí);洗板3次，加酶標(biāo)記底物。蓋上封板膜，室溫孵育20分鐘;洗板3次;加入TMB顯色，室溫避光溫育20分鐘終止反應(yīng);10分鐘內(nèi)在波長(zhǎng)450 nm讀值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各檢測(cè)孔內(nèi)VEGF濃度。

1．3．5 外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)為DCs 利用Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106ml－1。將細(xì)胞鋪于 24 孔板中培養(yǎng)，每孔 500 μl，約1×106個(gè)細(xì)胞/孔，并加細(xì)胞因子 GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(40 ng/ml)，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。隔日半量換液，培養(yǎng)5天誘導(dǎo)成DCs。

1．3．6 DCs表面 HLA-DR和 CD86表達(dá)的檢測(cè)

取外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)而來的細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS洗滌后加入 APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PECD86 mAb 4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗滌后400 μl重懸。利用FACS Calibur流式細(xì)胞儀，Cellquest軟件計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，選取CD11c陽(yáng)性細(xì)胞，進(jìn)而分析HLA-DR及CD86的表達(dá)。

1．3．7 重組VEGF(rhVEGF)對(duì)DCs表達(dá)HLA-DR、CD86的影響 將正常個(gè)體和胃癌患者PBMC誘導(dǎo)為未成熟DC后，實(shí)驗(yàn)分組加rhVEGF 100 ng/ml，對(duì)照組不加藥物，兩組分別刺激未成熟DC 24小時(shí)后，F(xiàn)CM檢測(cè)DC表達(dá)CD86的情況。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 胃癌與癌旁組織VEGF表達(dá)、DCs浸潤(rùn)密度的比較采取χ2檢驗(yàn)分析;VEGF表達(dá)強(qiáng)度與DCs浸潤(rùn)密度的關(guān)聯(lián)采取Spearman等級(jí)相關(guān)分析;VEGF、DCs雙陽(yáng)性細(xì)胞與TNM及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析采用秩和檢驗(yàn);胃癌患者血清VEGF濃度與健康個(gè)體的比較、HLA-DR及CD86陽(yáng)性DCs頻率的比較均采取t檢驗(yàn)。P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胃癌組織VEGF表達(dá)與DC浸潤(rùn)密度的關(guān)聯(lián)分析 首先對(duì)胃癌組織和癌旁組織分別用VEGF和CD11c的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)胃癌組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)率 56．33%(圖 1)、而癌旁組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)率僅為18．91%。另外，胃癌組織內(nèi)CD11c+細(xì)胞的表達(dá)陽(yáng)性率為60．56%(圖1)、而癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率為62．16%。結(jié)果顯示胃癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(χ2=16.452，P ＜0．001);而 CD11c+細(xì)胞表達(dá)率略低于癌旁組織(χ2=0．032，P=0．859)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無意義。為進(jìn)一步明確腫瘤組織VEGF表達(dá)是否與DCs浸潤(rùn)密度有相關(guān)性，對(duì)胃癌組織VEGF表達(dá)情況和DCs浸潤(rùn)情況分別判定為“－、+、++、+++”4個(gè)等級(jí)，利用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)強(qiáng)度與 DCs浸潤(rùn)程度呈反向關(guān)聯(lián)(表1，rS=－0.426，P ＜0．001)，提示胃癌細(xì)胞可通過分泌VEGF抑制腫瘤組織內(nèi)DCs的浸潤(rùn)。

圖1 免疫熒光法檢測(cè)胃癌組織內(nèi)VEGF和CD11c陽(yáng)性的細(xì)胞(×200)Fig．1 VEGF and CD11c staining in gastric cancer tissues detected by immunofluorescence technique(×200)

表1 胃癌細(xì)胞VEGF表達(dá)水平與DC密度相關(guān)性分析Tab．1 Correlation study of VEGF expression level in cancer cells and density of tumor-infiltrating DCs

2．2 胃癌組織VEGF陽(yáng)性DCs浸潤(rùn)的頻率與胃癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)分析 國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)DCs可分泌VEGF、內(nèi)皮素-1等參與腫瘤血管生成，特別是腫瘤局部微環(huán)境PGE2和鈣三醇的刺激可誘導(dǎo)DCs分泌大量的VEGF，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤血管生成和免疫逃逸［9］。因此本研究分析了胃癌組織和癌旁組織內(nèi)CD11c+VEGF+雙陽(yáng)性細(xì)胞的密度(圖 2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中 CD11c+VEGF+雙陽(yáng)性細(xì)胞頻率為43．66%，癌旁組織雙陽(yáng)性細(xì)胞率為10．81%，胃癌組織中雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于癌旁組織(表 2，χ2=14.112，P=0.001)。另外，我們分析了CD11c+VEGF+細(xì)胞密度與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性(表3:Z=－2.367，P=0．018;表 4:Z= － 2．574，P=0.010)，結(jié)果顯示CD11c+VEGF+細(xì)胞密度與疾病的進(jìn)展、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均正相關(guān)。

圖2 雙色熒光標(biāo)記檢測(cè)胃癌組織內(nèi)VEGF和CD11c雙陽(yáng)性細(xì)胞(×200)Fig．2 Immunofluorescent staining of VEGF and CD11c double positive cells in gastric cancer tissues(×200)

2．3 血清VEGF濃度及腫瘤組織內(nèi)DC浸潤(rùn)密度的關(guān)聯(lián)分析 為分析胃癌患者血清VEGF濃度和腫瘤組織內(nèi)DC浸潤(rùn)密度是否關(guān)聯(lián)，我們首先比較20例胃癌患者和20例健康個(gè)體血清內(nèi)VEGF水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清內(nèi) VEGF濃度均值為(354.98 ±231．11)pg/ml，而健康個(gè)體 VEGF 濃度均值為(66．11 ±62．86)pg/ml，胃癌患者血清內(nèi) VEGF濃度顯著增高(圖3，t=5．394，P ＜0．001)。進(jìn)一步分析胃癌患者血清VEGF濃度與腫瘤組織內(nèi)DCs密度的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)二者沒有明顯的關(guān)聯(lián)性(rS=0.114，P=0．63)。提示血清VEGF濃度對(duì)腫瘤組織內(nèi)DCs遷移沒有影響。

2．4 胃癌外周血單核細(xì)胞來源DCs表面HLA-DR及CD86表達(dá)的檢測(cè) 為觀察胃癌患者體內(nèi)DCs細(xì)胞的活性狀態(tài)，分離5例胃癌和5例健康個(gè)體外周血單核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)為DCs，分別檢測(cè)CD11c細(xì)胞表面MHCⅡ類分子(HLA-DR)和共刺激分子CD86的表達(dá)。HLA-DR在健康個(gè)體及胃癌患者表達(dá)率分別為(99．86 ±0．06)%、(84．44 ±8．73)%(t=4．241，P=0．003);CD86 在健康個(gè)體及胃癌患者表達(dá)率分別為(62.48±10.46)%、(40.82 ±5．42)%(t=4．111，P=0．003)(圖 4 ～6)。結(jié)果顯示，與健康個(gè)體相比，胃癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達(dá)均降低。為分析DCs表面CD86表達(dá)的降低是否與胃癌血清高水平VEGF有關(guān)，我們將rhVEGF作用胃癌患者來源的DCs細(xì)胞，測(cè)得rhVEGF組的CD86表達(dá)為(37．94±6．36)%，對(duì)照組為(56.70±7.80)%，(t=5．104，P=0．001);而 rhVEGF 作用健康個(gè)體來源的 DCs細(xì)胞，rhVEGF組的 CD86為(54．30 ±3．81)%，對(duì)照組為(57．08 ±6．43)%，(t=0.832，P=0．430)(圖 7)。結(jié)果證實(shí)重組VEGF可直接下調(diào)胃癌患者 DCs表面 CD86的表達(dá)。

表2 胃癌與癌旁組織內(nèi)CD11c+VEGF+細(xì)胞密度比較Tab．2 Comparative analysis of density of CD11c+VEGF+cells in gastric cancer tissues and adjacent tissues

表3 腫瘤組織內(nèi)CD11c+VEGF+細(xì)胞密度與TNM分期關(guān)聯(lián)性分析Tab．3 Correlation study of density of CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with TNM stages

表4 腫瘤組織內(nèi)CD11c+VEGF+細(xì)胞密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)性分析Tab．4 Association correlation study of densitiesof CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with lymph node metastasis

圖3 胃癌患者血清VEGF濃度較正常個(gè)體顯著增高Fig．3 Serum level of VEGF is higher in gastric cancer patients than healthy controls

圖4 外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)而來DCs表面HLA-DR和CD86的檢測(cè)Fig．4 Detection of HLA-DR and CD86 expression on peripheral blood monocyte-derived DCs by flow cytometry

圖5 胃癌患者外周血單核細(xì)胞來源DCs表面HLA-DR的表達(dá)降低Fig．5 Decreased expression of HLA-DR on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

圖6 胃癌患者外周血單核細(xì)胞來源DCs表面CD86的表達(dá)降低Fig．6 Decreased expression of CD86 on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

圖7 重組VEGF下調(diào)胃癌患者外周血單核細(xì)胞來源DCs表面表達(dá)HLA-CD86Fig．7 Recombinant VEGF down-regulated CD86 expression on DCs in gastric cancer

3 討論

本研究基于胃癌臨床標(biāo)本，首先利用免疫熒光和ELISA方法分別分析了腫瘤組織內(nèi)胃癌細(xì)胞VEGF表達(dá)、血清VEGF濃度與腫瘤組織內(nèi)DCs浸潤(rùn)密度的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞原位表達(dá)VEGF與DCs浸潤(rùn)存在明顯的負(fù)相關(guān)，而血清VEGF濃度對(duì)腫瘤DCs浸潤(rùn)無明顯影響，提示腫瘤微環(huán)境內(nèi)高濃度VEGF表達(dá)可通過抑制DCs的遷移或分化，從而介導(dǎo)免疫逃逸。另外，本研究比較了胃癌組織與癌旁組織分泌VEGF的DCs頻率，發(fā)現(xiàn)癌組織內(nèi)DCs分泌VEGF的頻率顯著高于癌旁組織，提示腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的DCs可能通過分泌VEGF來促進(jìn)腫瘤血管生成而參與疾病進(jìn)展。最后，本研究證實(shí)外周血單核細(xì)胞來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達(dá)均降低，且重組VEGF可直接抑制DCs表達(dá)CD86，說明胃癌患者體內(nèi)DCs處于低活性或負(fù)向免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)。因此，本研究為VEGF參與胃癌進(jìn)展及免疫逃逸提供了直接依據(jù)。

腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)時(shí)分泌大量VEGF，促進(jìn)腫瘤局部新生血管的生成，且同時(shí)抑制局部DCs的功能。國(guó)外研究證實(shí)VEGF在體外和體內(nèi)抑制DCs細(xì)胞的分化、以及抑制LPS誘導(dǎo)的DCs成熟，抑制DCs分泌 IL-12［10，11］。給小鼠注射重組 VEGF 蛋白可拮抗FILT3對(duì)DCs的刺激作用［12］。在腫瘤細(xì)胞和DCs共培養(yǎng)體系中，加入 VEGF抗體，可促進(jìn)CD34+細(xì)胞向DCs的分化［13］。本研究證實(shí)胃癌細(xì)胞分泌VEGF與DCs浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，但胃癌細(xì)胞來源的VEGF是直接抑制DCs的浸潤(rùn)還是抑制DCs源自造血干細(xì)胞的分化發(fā)育過程，尚需深入研究。

血清高水平VEGF促進(jìn)腫瘤患者的進(jìn)展，與外周血循環(huán)DCs的密度呈負(fù)相關(guān)［14］。本研究則顯示血清VEGF水平與腫瘤浸潤(rùn)DCs無關(guān)，這提示腫瘤組織內(nèi)DCs活性主要受局部腫瘤細(xì)胞來源VEGF的影響。另外，胃癌患者外周血單核細(xì)胞來源的DCs表面HLA-DR和CD86均降低，而重組VEGF直接抑制DCs表達(dá)CD86，但VEGF是否直接影響DCs對(duì)CD4+T/CD8+T細(xì)胞的活化，或發(fā)揮調(diào)節(jié)性DCs的活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的產(chǎn)生、增殖及活性，需要深入分析。

腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞和局部浸潤(rùn)的DCs之間存在相互作用(Crosstalk)，特別在腫瘤晚期，腫瘤細(xì)胞來源的IL-10、TGF-β、PGE2往往誘導(dǎo)局部DCs具有免疫調(diào)節(jié)和耐受活性，而不是免疫激活功能，主要表現(xiàn)為低表達(dá) TLR4、MHC Ⅱ類分子、CD40、CD80、CD86 和 IL-12，而分泌較多 IL-10［15］。我們?cè)谖赴┙M織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了較高頻率VEGF陽(yáng)性的DCs細(xì)胞，且其與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)性，提示該群DCs具有免疫調(diào)節(jié)活性，但這群DCs在胃癌組織內(nèi)如何被誘導(dǎo)產(chǎn)生以及其他表型特點(diǎn)需要深入研究，進(jìn)而對(duì)篩選有效抑制該群DCs活性或誘導(dǎo)DCs向免疫激活方向分化的藥物具有重要意義。

綜上所述，胃癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤組織DCs浸潤(rùn)密度負(fù)相關(guān)，而胃癌患者血清高濃度VEGF與其外周血單核細(xì)胞來源的DCs表面HLADR和CD86表達(dá)降低有關(guān)，腫瘤組織內(nèi)分泌VEGF的DCs頻率與胃癌進(jìn)展呈正相關(guān)，提示采取靶向抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF和增強(qiáng)DCs功能的治療方法，將有望取得較好的抗腫瘤治療效果。

1 Tie J，Desai J．Antiangiogenic therapies targeting the vascular endothelia growth factor signaling system［J］．Crit Rev Oncog，2012;17(1):51-67．

2 Eichmann A，Simons M．VEGF signaling inside vascular endothelial cells and beyond［J］．Curr Opin Cell Biol，2012;24(2):188-193．

3 Kim H，Kataru R P，Koh G Y．Regulation and implications of inflammatory lymphangiogenesis［J］．Trends Immunol，2012;33(7):350-356．

4 Sheng K C，Wright M D，Apostolopoulos V．Inflammatory mediators hold the key to dendritic cell suppression and tumor progression［J］．Curr Med Chem，2011;18(36):5507-5518．

5 黃海力，吳本儼，龍偉締et al．樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)進(jìn)展期胃癌生物學(xué)行為和預(yù)后的影響［J］．中華腫瘤學(xué)雜志，2003;25(5):468-471．

6 Nat sugoe S，Tokuda K，Nakajo A et al．Clinical impact of intratumoralnatural killer cell and dendritic cell infiltration in gastric cancer［J］．Cancer Lett，2000;159(1):103-108．

7 Ohashi S，Okamura S，Urano F et al．Clinicopathological variables associated with lymph node metastasis in submucosal invasive gastric cancer［J］．Gastric Cancer，2007;10(4):241-250．

8 Blanchot-Jossic F，Jarry A，Masson D et al．Up-regulated expression of ADAM17 in human colon carcinoma:co-expression with EGFR in neoplastic and endothelial cells［J］．J Pathol，2005;207(2):156-163．

9 Sozzani S，Rusnati M，Riboldi E et al．Dendritic cell-endothelial cell cross-talk in angiogenesis ［J］．Trends Immunol，2007;28(9):385-392．

10 Bennaceur K，Chapman J，Brikci-Nigassa L et al．Dendritic cells dysfunction in tumour environment［J］．Cancer Lett，2008;272(2):186-196．

11 Lissoni P，Malugani F，Bonfanti A et al．Abnormally enhanced blood concentrations of vascular endothelial growth factor(VEGF)in metastatic cancer patients and their relation to circulating dendritic cells，IL-12 and endothelin-1［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2001;15(2):140-144．

12 Ohm J E，Shurin M R，Esche C et al．Effect of vascular endothelial growth factor and FLT3 ligand on dendritic cell generation in vivo［J］．J Immunol，1999;163(6):3260-3268．

13 Michielsen A J，Hogan A E，Marry J et al．Tumour tissue microenvironment can inhibit dendritic cell maturation in colorectal cancer［J］．PLoS One，2011;6(11):e27944．

14 Huang A，Gilmour J W，Imami N et al．Increased serum transforming growth factor-beta1 in human colorectal cancer correlates with reduced circulating dendritic cells and increased colonic Langerhans cell infiltration ［J］．Clin Exp Immunol，2003;134(2):270-278．

15 Ma Y，Shurin G V，Gutkin D W et al．Tumor associated regulatory dendritic cells［J］．Semin Cancer Biol，2012;22(4):298-306．