RP-HPLC法同時測定腎康注射液中5種蒽醌類成分

徐守竹， 謝艷華， 張曉衛， 劉媛媛， 王四旺*， 呂延英

(1．第四軍醫大學藥學院天然藥物學教研室，陜西西安710032;2．西安世紀盛康藥業有限公司，陜西 西安710032)

腎康注射液是由大黃、丹參、紅花、黃芪四味中藥經現代工藝制備而成，具有降逆瀉濁、益氣活血之功，適用于治療慢性腎功能衰竭。中藥大黃在復方中充當君藥，現代研究證實大黃蒽醌類成分在相關疾病防治過程中發揮重要作用［1］。對腎康注射液中蒽醌類成分的測定已有報道［2］，但其僅對總蒽醌成分進行測定。因此，對腎康注射液中5種蒽醌類成分進行定量檢測，對研究其物效基礎及組方原理具有重要意義。本實驗建立了一種能同時對腎康注射液中5種蒽醌類成分進行定量測定的方法，為腎康注射液的深入研究和提高質量控制標準提供了依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 島津 LC2010-AT高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)，包括紫外可見波長檢測器、柱溫箱、LC Solution色譜工作站;賽多利斯ME235S電子分析天平 (Sartorius，德國);超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司);水浴鍋 (北京科偉永興儀器有限公司);旋轉蒸發儀 (西安太康儀器設備有限公司)。

1．2 試藥 腎康注射液 (20 mL/支，陜西西安世紀盛康藥業有限公司，批號 201206022、201201056、201203041);蘆薈大黃素對照品 (批號110706-2000436)，大黃酸對照品 (批號110756-200087)，大黃素對照品 (批號 110756-200110)，大黃酚對照品 (批號 0796-2002208)，大黃素甲醚對照品 (批號110756-0206)均購于中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純 (Honeywell，美國)，三氯甲烷、鹽酸、磷酸、乙醇 (分析純)，自制去離子水。大黃、丹參、紅花、黃芪藥材均購于西安達仁堂中藥店，經鑒定符合《中國藥典》2010年版規定［3］。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與系統適用性試驗 Stamsil-BP C18色譜柱 (250 mm×4．6 mm，5μm);流動相為A(甲醇)-B(0．2%磷酸水溶液)梯度洗脫，0～25 min，75% ～100%A;檢測波長 440 nm;柱溫30℃;體積流量1 mL/min;進樣量20μL。

2．2 對照品溶液的配制 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量于50 mL量瓶中，加甲醇超聲5 min溶解并定容。即得分別含蘆薈大黃素130μg/mL、大黃酸53．4 μg/mL、大黃素 67．6 μg/mL、大黃酚 61．6 μg/mL、大黃素甲醚54．4μg/mL的對照品溶液。

2．3 混合對照品溶液的制備 分別精密量取上述對照品溶液1 mL，于10 mL量瓶中，甲醇定容即得質量濃度分別為13μg/mL、5．34μg/mL、6．76 μg/mL、6．16 μg/mL、5．44 μg/mL 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的混配溶液。

2．4 供試品溶液的制備 精密量取腎康注射液10 mL于250 mL圓底燒瓶，加8%HCl 10 mL，超聲處理5 min，加入三氯甲烷30 mL，水浴回流1 h，放冷，移置分液漏斗中 (用少量三氯甲烷多次清洗圓底燒瓶)，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷多次萃取直至無蒽醌類陽性反應，合并三氯甲烷，再用適量去離子水洗至中性，減壓回收三氯甲烷至干，殘渣用甲醇溶解并移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進樣前用0．45μm濾過取續濾液20μL進樣。

2．5 缺大黃陰性對照溶液的制備 取丹參、紅花、黃芪藥材適量，按腎康注射液制備方法［4］，制備缺大黃注射液，對缺大黃注射液按2．4項處理，即得缺大黃供試液。

2．6 大黃陽性對照溶液的制備 取大黃藥材適量，按腎康注射液制備方法制備大黃注射液，對大黃注射液的處理同2．4項，即得大黃注射液。

3 方法學考察

3．1 空白干擾試驗 取缺大黃注射液進樣20μL，實驗結果表明，陰性對照溶液對所測組分不產生干擾。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3．2 線性關系考察 分別配制5種蒽醌類成分系列質量濃度的對照品溶液 (n=7)，在上述色譜條件下分別進樣20μL，測定結果以質量濃度為橫軸(X)，以相應峰面積為縱軸 (Y)，進行線性回歸，繪制標準曲線，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回歸方程 (見表1);結果表明各成分分別在相應的線性范圍內線性關系良好。

表1 5種蒽醌類成分的回歸方程及線性范圍Tab.1 Linear relationships and concentration ranges of the five anthraquinones

3．3 精密度考察 量取上述各對照品溶液1 mL，于10 mL量瓶中，甲醇定容到刻度，連續進樣6次，測定峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為1．16%、1．28%、1．75%、1．59%、1．71%，表明在實驗條件下精密度良好。

3．4 穩定性試驗 取同一批供試品溶液 (批號:201203041)按照2．4項方法處理，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測峰面積。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為 2．67%、2．84%、2．08、3．05%、2．49%;表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

3．5 重復性實驗 精密量取腎康注射液 (批號:201203041)6份，分別按照2．4項下方法制備供試品溶液，測定計算得供試品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的質量分數分別為24．768 μg/mL、10．691 μg/mL、11．474 μg/mL、8．829 μg/mL、1．687 μg/mL，RSD 值 分 別 為2．01%、2．75%、2．42%、1．43%、1．55%。

3．6 加樣回收率實驗 精密吸取已測定的同一供試品溶液 (批號:201201056)6份，每份10 mL，分別加入1 mL混合對照品溶液，按照2．4項下方法制備供試品溶液。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚回收率及RSD值分別為101．3% 、 1．28%， 97．9%、 2．89%， 103．7% 、2．07%，96．7%、2．76%及 102．4%、1．78%。

3．7 樣品測定 精密量取腎康注射液10 mL，按2．4項方法制備樣品溶液，進樣20μL，每樣測定5次。結果見表2。

表2 5種蒽醌類成分的測定結果Tab.2 Determ ination results of the five anthraquinones

4 討論

4．1 腎康注射液中5種蒽醌類成分的量為蘆薈大黃素＞大黃素＞大黃酸＞大黃酚＞大黃素甲醚。現代藥理研究證實大黃蒽醌類成分在防治腎臟疾病中發揮重要作用，尤其大黃酸［5-7］和大黃素［8-9］的報道頗多。開展腎康注射液中物效基礎研究對將其開發為高效、低毒、成分明確的現代中藥即“分子中藥”［10］具有重要意義。

4．2 大黃蒽醌類成分的提取工藝已比較成熟，本實驗在崔紅花等［11］研究基礎上，分別用超聲法、加熱回流法和索氏提取法對腎康注射液進行提取，最終確定處理方法2．4項操作簡單，成分得率高。

4．3 流動相選擇時，考慮蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的極性較小，宜采用有機相比例較大的流動相，這5種成分都含有酚羥基略顯酸性，故加入酸以抑制拖尾現象。本實驗分別考察了0．1%、0．2%、0．5%磷酸及乙酸，結果顯示0．2%以上上述2種酸，峰形良好且磷酸略優于乙酸，故選擇0．2%的磷酸水作為B相。同樣考察了有機相甲醇及乙腈，兩者都能較好地分離各成分，但是甲醇比乙腈經濟，故選甲醇為A相。在此梯度下各峰分離度好，干擾小，出峰時間適中。

4．4 色譜柱的選擇時，根據上述流動相考察了Yilite Hypersil BDSC18色譜柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Ultamate AQ C18色譜柱 (250 mm × 4．6 mm，5μm)、Phenomenex Lnna C18色譜柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Stamsil-BPC18色譜柱 (250 mm×4．6 mm，5μm)。各種色譜柱對各峰的分離度及峰形影響較小，唯獨出峰時間略有變化。

4．5 其他色譜條件選擇時，在Waters 2695 HPLCDAD，預試實驗中，全波長掃描顯示在440 nm下峰形良好，基線平穩，干擾成分少，故選擇440 nm為檢測波長。體積流量、柱溫等條件對定量測定影響較小。

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［2］萬 麗，劉友平，李明權．腎康注射液中蒽醌類成分含量測定［J］．時珍國醫國藥，1999，10(4):224-225．

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