丙戊酸鈉對燒傷休克大鼠肺微血管內皮細胞活化和通透性的影響

周國勇，胡 森，賈赤宇

嚴重燒傷早期往往出現大量體液和血漿滲出到體外及第三間隙，其引起的低血容量性休克是嚴重燒傷后器官功能損傷及預后不良的病理生理基礎。在一些特殊情況下，如現代戰場或自然災害現場，常規休克補液治療往往難以及時實施［1］。因此，休克的藥物治療逐漸發展為目前研究的熱點［2-5］。

丙戊酸鈉(VPA)是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACI)，以往作為抗癲癇藥物。國內外最新研究表明，VPA具有良好的生命維持作用，其表現為可延長動物失血性休克時的存活時間，但作用機制尚不明確［6］。另有研究顯示，HDACI可以抑制炎癥細胞活化、聚集，減少炎癥介質釋放，減輕炎癥反應［7］。因此我們假設VPA能抑制燒傷休克大鼠肺組織炎癥反應，保護微血管內皮細胞功能，降低其肺血管通透性，從而改善重度燒傷休克的預后。為了驗證此假設，我們進行了如下實驗。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 VPA、2-甲基-2-戊烯酸(2M2P，Sigma公司，美國);Rabbit Anti-VEGF、Anti-ICAM-1和Anti-E-selectin(Invitrogen，美國);TUNEL細胞凋亡試劑盒(Roche，美國)。

1.2 50%TBSAⅢ度燙傷休克大鼠模型制備 雄性清潔級SD大鼠，體重220～250 g(軍事醫學科學院實驗動物中心)。購入后適應性飼養1周，自由飲食。實驗前12 h禁食，自由飲水。氯胺酮+速眠新(2∶1，0.5 ml/kg)肌注麻醉后，大鼠背、腹部及雙下肢備皮，給予水浴(背部及雙下肢均為15 s、腹部8 s);假燙組水溫為37℃;燙傷組水溫為80℃。觀察動物一般狀況，頸動脈置管監測平均動脈壓，燙傷深度病理檢查證實。

1.3 實驗方案及分組 實驗分為假燙組、燙傷組、燙傷+2M2P組與燙傷+VPA組。根據各組死亡率不同補足各時間點存活大鼠至6只(燙傷組除外)，總計使用大鼠150只。假燙組和燙傷組程序按上述模型制作過程進行，2M2P組和VPA組在燙傷后即刻皮下注射100 mg/ml相應藥物300 mg/kg，假燙組及燙傷組皮下注射3 ml/kg生理鹽水。

1.4 取材與指標檢測 分別于燙傷后2 h，6 h和12 h處死實驗動物。腹主動脈取血，檢測紅細胞壓積(HCT)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌酐(Cr)。取新鮮肺組織，應用干濕重法檢測肺組織含水率，伊文斯藍(Evans blue，EB)比色法檢測肺微血管通透性，HE染色觀察肺組織病理變化，免疫組織化學染色Power Vision兩步法檢測肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelium cell，PMEC)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、E-選擇素(E-selectin)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達，以CMIAS病理圖像分析系統對病理圖像進行定量分析，TUNEL法檢測肺微血管內皮細胞凋亡率，采用 Spot Advance Version 4.0.2采集圖像并分析計算。

2 結果

2.1 50%TBSAⅢ度燙傷休克大鼠模型的鑒定

2.1.1 一般狀況:燙傷后大鼠早期即出現精神萎靡、活動少、不進食，死亡前有戰栗、抽搐等表現。背、腹部及雙下肢燙傷創面呈皮革狀，創面發白，部分出現潰瘍。

2.1.2 平均動脈壓(MAP):致傷后2 h大鼠MAP即迅速下降至約50 mmHg;6 h左右，MAP再次快速下降，隨后多數大鼠死亡，12 h存活率為0。

2.1.3 臟器功能及死亡率:致傷后6 h，燙傷組大鼠的血漿CK-MB、ALT、Cr等肝腎臟器功能指標較假燙組顯著升高(P＜0.05)，見表1;燙傷組大鼠6 h和12 h死亡率分別為80%(24/30)和100%(12/12)。

表1 2組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷6 h臟器功能變化(±s)

表1 2組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷6 h臟器功能變化(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃;aP ＜0.05

組別 鼠數 肌酸激酶同工酶(IU/L)丙氨酸轉氨酶(U/L)肌酐(μmol/L)假燙組6 11.9 ±1.3 41.67 ±6.35 57.83 ±5.35燙傷組 6 26.8 ±3.6a 108.89 ±10.45a89.84 ±8.97a

2.2 觀察指標

2.2.1 HCT:燙傷組肺組織HCT較假燙組明顯增加(P＜0.05)，燙傷+VPA組及燙傷+2M2P組2 h和6 h HCT均明顯低于燙傷組(P＜0.05)，燙傷+VPA組較燙傷+2M2P組降低更明顯(P＜0.05)，見表2。

2.2.2 肺組織含水率:傷后2 h和6 h，燙傷組肺組織含水率較假燙組明顯增加(P＜0.05)，而燙傷+2M2P組和燙傷+VPA組顯著低于燙傷組(P＜0.05)，但仍高于假燙組。治療組間相比，燙傷+VPA組各時間點均低于燙傷+2M2P組，但只有6 h差異顯著(P ＜0.05)，見表2。

2.2.3 肺血管通透性:傷后2 h和6 h，燙傷組EB含量明顯高于假燙組，而燙傷+2M2P組和燙傷+VPA組比燙傷組顯著降低(P＜0.05);治療組間相比，傷后6 h和12 h時間點燙傷+VPA組肺血管通透性顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見表2。

2.2.4 PMEC凋亡率:燙傷組2 h和6 h PMEC凋亡率較假燙組顯著升高;與燙傷組相比，燙傷+VPA組和燙傷+2M2P組2 h和6 h凋亡指數均顯著降低;治療組間相比，燙傷+VPA組各時間點均顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見表2。

2.3 肺組織病理學變化 HE染色后鏡下觀察可見:假燙組大鼠肺組織結構清晰，未見肺水腫、間質水腫及炎癥細胞的浸潤。而燙傷組和燙傷+2M2P組大鼠傷后2 h肺組織可見部分肺泡壁增厚，毛細血管充血，少量肺泡腔內出血。傷后6 h及12 h，上述變化加重，肺泡壁明顯增厚，毛細血管內皮腫脹，少數肺泡中充滿嗜伊紅液體，肺泡腔內多見出血，并伴有中性粒細胞和單核細胞浸潤，支氣管黏膜水腫、上皮壞死脫落，部分區域可見肺大泡形成。燙傷+VPA組大鼠傷后2 h肺組織結構尚清晰，個別區域毛細血管輕度充血，未見明顯組織水腫及出血。傷后6～12 h可見肺泡壁輕度增厚，毛細血管充血較前明顯，血管內皮細胞輕度腫脹，少數肺泡腔可見出血，部分肺泡腔閉塞，支氣管黏膜輕度水腫，炎癥細胞輕度浸潤，黏膜纖毛少量脫失。見圖1。

表2 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后觀察指標的變化(±s)

表2 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后觀察指標的變化(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃，燙傷+2M2P組燙傷后即刻皮下注射2-甲基-2-戊烯酸300 mg/kg，燙傷+VPA組燙傷后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg。與假燙組同時間比較，aP＜0.05;與燙傷組同時間比較，cP＜0.05;與燙傷+2M2P組同時間比較，eP＜0.05

組別 鼠數 紅細胞壓積(%)肺組織含水率(%)伊文斯藍濃度(μg/g)肺微血管內皮細胞凋亡率(%)假燙組2 h 6 35.42 ±1.13 65.58 ±2.39 41.39 ±3.78 4.31 ±0.54 6 h 6 34.24 ±1.52 66.23 ±3.12 42.04 ±4.38 4.50 ±0.38 12 h 6 35.62 ±1.61 64.84 ±2.35 40.81 ±3.89 4.76 ±0.62燙傷組2 h 6 43.74 ±1.23a 72.15 ±2.41a 68.43 ±4.37a 19.44 ±2.25a 6 h 6 49.57 ±1.12a 79.38 ±2.46a 74.29 ±7.46a 21.76 ±2.86a 12 h0－－－－燙傷+2M2P組2 h 6 40.32 ±1.14c 69.32 ±1.34c 51.73 ±3.24c 15.34 ±1.74c 6 h 6 45.72 ±1.37c 76.52 ±2.12c 67.52 ±4.79c 16.43 ±1.82c 12 h 6 43.26 ±1.73 72.39 ±2.57 64.92 ±3.57 18.46 ±2.02燙傷+VPA組2 h 6 38.26 ±1.46ce 68.26 ±2.26c 49.74 ±4.19c 12.03 ±1.33ce 6 h 6 42.53 ±1.26ce 73.16 ±1.86ce 58.40 ±3.19ce 13.72 ±1.95ce 12 h 6 40.24 ±1.21e 71.83 ±2.15 57.28 ±4.53e 15.13 ±1.62e

圖1 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織病理學變化(HE×200)

2.4 肺組織 VEGF、ICAM-1、E-selectin表達VEGF、E-selectin和ICAM-1主要于血管內皮細胞受損后表達，E-selectin和ICAM-1是炎癥反應時中性粒細胞黏附于血管內皮細胞并向血管外轉移的主要配體。傷后2～6 h，燙傷+VPA組肺組織中上述因子的陽性率顯著低于燙傷組(P＜0.05)，燙傷 +2M2P組與燙傷組相比無統計學意義(P＞0.05)。治療組間相比，傷后各時間點燙傷+VPA組均顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見表3。

表3 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織相關因子表達陽性率的比較(±s)

表3 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織相關因子表達陽性率的比較(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃，燙傷+2M2P組燙傷后即刻皮下注射2-甲基-2-戊烯酸300 mg/kg，燙傷+VPA組燙傷后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg。與假燙組同時間比較，aP＜0.05;與燙傷組同時間比較，cP＜0.05;與燙傷 +2M2P 組同時間比較，eP ＜0.05

組別 鼠數 血管內皮細胞生長因子E-選擇素 細胞間黏附分子-1假燙組2 h 6 0.032 ±0.011 0.057 ±0.012 0.048 ±0.022 6 h 6 0.031 ±0.008 0.047 ±0.011 0.050 ±0.017 12 h 6 0.035 ±0.012 0.052 ±0.009 0.049 ±0.013燙傷組2 h 6 0.360 ±0.017a0.320 ±0.013a0.450 ±0.023a 6 h 6 0.390 ±0.018a0.370 ±0.014a0.470 ±0.019a 12 h0－－－燙傷+2M2P組2 h 6 0.340 ±0.016 0.330 ±0.015 0.420 ±0.025 6 h 6 0.370 ±0.020 0.350 ±0.021 0.460 ±0.026 12 h 6 0.340 ±0.015 0.350 ±0.017 0.440 ±0.017燙傷+VPA組2 h 6 0.220 ±0.015ce0.240 ±0.013ce0.300 ±0.018ce 6 h 6 0.270 ±0.013ce0.280 ±0.016ce0.340 ±0.021ce 12 h 6 0.260 ±0.017e0.270 ±0.020e0.330 ±0.025e

3 討論

戰爭、大規模突發事故及自然災害(如火災、地震)時，往往短時間內成批出現休克傷員;但由于交通破壞、醫療資源匱乏，使得常規靜脈補液等抗休克治療難以實施，從而大大增加病死率。因此，無靜脈液體復蘇條件下休克救治技術的研究對于戰場、事故及災害等情況的現場早期救治具有重要意義。無靜脈液體復蘇條件時休克救治技術主要有口服液體復蘇、抗休克褲、生命維持和細胞保護藥物等。其中生命維持與細胞保護藥物作為一種簡便可行的治療方案，具有廣闊的應用前景，是國內外研究的熱點。

多項研究表明，HDACI在失血、創傷及膿毒癥等休克模型中具有抗休克和提高存活率的作用［8-11］。Gonzales等［12］研究發現:60% 血容量失血大鼠傷前及傷后即刻皮下注射VPA，致傷后12 h VPA組大鼠存活率為70%，而生理鹽水對照組大鼠存活率則為0;VPA組大鼠生存時間是生理鹽水對照組大鼠的5倍。胡森等［13］發現:在無靜脈復蘇條件下，VPA能有效地維持50%TBSAⅢ度燒傷休克犬的平均動脈壓，保護臟器功能，并顯著提高動物的24、48 h存活率;白慧穎等［14］研究則表明VPA可以改善燙傷休克大鼠心肌酶學指標，減輕其組織損傷。本研究證實了VPA顯著改善燒傷休克主要靶器官之一的肺組織損傷，具有潛在應用價值。

在重度燒傷早期，由于血漿大量滲出到體外及第三間隙，血液濃縮，可表現為HCT上升;雖然此時紅細胞受多種因素影響出現大量破壞，但總體上容量的下降表現更明顯，因此HCT可間接反映燒傷休克時血容量降低程度。肺組織含水率是燒傷休克大鼠炎癥組織水腫程度的直接體現。EB比色法直接體現了肺微血管通透性的變化。大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后2～12 h血HCT持續升高原因即在于血容量丟失，血細胞大量濃縮。肺組織含水率增加，出現肺水腫、炎癥細胞浸潤等病理改變，表明重度燒傷后由于炎癥介質的大量釋放，損傷微血管內皮細胞，導致肺微血管通透性增加，血液從血管中轉移到血管外，引起有效循環血量的降低;炎癥細胞如中性粒細胞和巨噬細胞的活化和轉移則直接損傷了肺泡組織的換氣功能。燙傷后即刻給予300 mg/kg VPA皮下注射，血HCT和肺組織含水率顯著低于燙傷組，肺水腫等病理改變也明顯減輕。

組蛋白乙酰化是基因轉錄調控的關鍵環節［15］，VPA作為一種HDACI，其對組蛋白乙酰化水平的調節可能是生物功能多樣化的主要原因［16］。Fu等［17］研究表明:VPA主要作用于HDACⅠ類分子(HDAC1與HDAC3)，影響細胞生存與凋亡相關基因的表達，從而發揮生命維持與細胞保護作用。2M2P分子結構與VPA類似，但對組蛋白乙酰化的抑制作用較弱。本實驗通過對照藥物2M2P與VPA，結果也表明VPA的作用機制與其對組蛋白乙酰化水平的調控相關。

在燒傷休克治療中，我們認為VPA對臟器功能的保護作用可能與其對炎癥因子表達的調控有關。研究表明，脂多糖(LPS)致小鼠膿毒癥模型給予單次口服 HDACI SAHA 可以降低 TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平，并呈劑量依賴性［18］。重度燒傷后也易出現上述炎癥因子的瀑布樣釋放，形成全身性炎癥反應，是心、肝、肺等重要臟器損傷的病理生理基礎。在肺組織中，這些炎癥因子的具體作用表現為損傷PMEC，增加血管通透性，促進中性粒細胞和巨噬細胞的活化和血管外轉移。在本實驗中，VPA對重度燒傷后血管活性因子表達率的調控及肺組織病理學觀察結果也充分證實了上述推論。

綜上所述，本實驗證實了VPA在重度燒傷休克動物模型中能抑制內皮細胞活化，減輕其損傷，改善血管通透性，從而保護肺臟功能;其作用可能與其對組蛋白乙酰化調控相關，但具體途徑尚不清楚。進一步研究可針對明確其具體基因和信號途徑調控機制入手，為HDACI在燒傷休克治療的臨床應用提供更明確的實驗依據。

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