維生素E對高脂血癥小鼠血管內皮細胞凋亡相關蛋白基因表達的影響

霍 陽，初巍巍，宋 濤，陳 悅，趙躍萍，賈大林

體內大量研究均證實，血管內皮細胞凋亡可能是發生動脈粥樣硬化的早期事件，并可促進動脈粥樣硬化的形成、斑塊侵蝕和急性冠脈綜合征的發展［1］。細胞凋亡是生物體的一種與細胞壞死截然不同的自殺程序，是維持細胞群體數量相對恒定的主動耗能過程。Bax蛋白基因需要與其家族中Bcl-2蛋白基因相互協調才能發揮抑制凋亡的效應，形成凋亡調控系統。當Bax同源二聚體形成時，便可誘導細胞的凋亡，隨著Bcl-2蛋白表達量上升，Bax二聚體逐漸分開，與Bcl-2蛋白形成更穩定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而中和Bax蛋白誘導細胞凋亡的作用［2］。這種二聚體調控細胞對凋亡的易感性，決定細胞的存亡，兩蛋白的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素［3］。

維生素E作為人體一種重要的脂溶性抗氧化劑，可改善氧化應激狀態，減少脂質氧化，調節脂質代謝，保護血管內皮細胞［4］。張思明等［5］研究表明維生素E水平與血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及血壓水平呈負相關。而維生素E是否能通過降低血清TG與TC濃度來抑制血管內皮細胞凋亡值得我們去進一步探索，為今后臨床預防高脂血癥的并發癥提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:50只ICR雄性性成熟小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，6～8周齡，體重為28～32 g，合格證號:SCXK-(京)2007-0001。

1.1.2 主要試劑:維生素E為Sigma公司產品;TG、TC檢測所采用的7020全自動生物化學分析儀為日本日立公司產品，TG、TC檢測試劑盒為上海復星長征有限公司產品，RT-PCR試劑盒為日本TaKa-Ra公司產品，Bcl-2、Bax、GAPDH引物為日本TaKa-Ra公司產品，Trizol試劑為Introgen公司產品。

1.1.3 實驗飼料:高脂飼料由3%膽固醇、10%豬油、0.3%甲硫氧嘧啶、0.4%膽酸鈉組成，其與普通飼料均購自北京科澳協力飼料有限公司［合格證號:京動(2000)第015號］。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組與處理:將50只小鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組10只，人工控溫20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養，自由飲水取食。高脂血癥小鼠模型參考［1］。A組:高脂飼料喂養;B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;E組:普通飼料喂養。維生素E均用橄欖油配成混懸液，配好后避光4℃保存，現用現配。連續灌胃4周，最后一次灌胃后禁食10 h，用頸椎脫臼法將小鼠處死并放于冰臺上，在無菌條件下抽取靜脈血并剪開胸腹腔，迅速分離腹主動脈。

1.2.2 RT-PCR法測定Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達:稱取30 mg腹主動脈并按Trizol試劑盒說明書提取出總RNA。鑒定RNA純度與完整性后按試劑盒說明以(oligo)dT為引物反轉錄合成cDNA第一鏈，以2 μl的cDNA為模板按試劑盒說明進行PCR擴增，GAPDH為內參照。

反應條件:94℃、1 min，Tm(根據不同的退火溫度定)50 s;72℃、1 min，Tm(根據不同的退火溫度定)30 s，進行40個循環。擴增產物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min，紫外燈260 nm下進行檢測。用Quantity one軟件分析各目的基因的條帶密度，以管家基因GAPDH為內參照計算各個樣本的基因條帶密度的相對值。各引物由聚丙烯酰胺凝膠電泳(PCGE)純化，具體基因序列如下:

1.2.3 TG、TC的檢測:抽取的靜脈血用高速離心機(3000 r/min)離心5 min后，用吸管將上層血清吸出，隨后放入容積為1.5 ml的離心管中，并立即放于－30℃冰箱中冷凍保存，檢測時按試劑盒說明分別檢測TG、TC，所取標本均在1周內測定。

1.3 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料結果用均數±標準差(±s)表示，采用方差分析，相關性分析使用Spearman相關分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Bax基因mRNA水平的表達量 A組主動脈內膜Bax基因mRNA水平的表達量高于B、C、D、E組(P＜0.05)，B、C、D組隨著維生素E劑量的增加mRNA水平的表達量逐漸減少，且3組間活性均有統計學差異(P＜0.05)，B、C、D組mRNA水平的表達量均高于E組(P＜0.05)，結果見圖1、表1。

2.2 Bcl-2基因mRNA水平的表達量 A組主動脈內膜Bcl-2基因mRNA水平的表達量低于B、C、D、E組(P＜0.05)，B、C、D組隨著維生素E劑量的增加表達量逐漸升高，且3組間活性均有統計學差異(P＜0.05)，B、C、D組表達量均低于 E組(P＜0.05)，結果見圖1、表1。

2.3 Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達量比值A組主動脈內膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達量比值高于B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組隨著維生素E劑量的增加mRNA水平的表達量比值逐漸減少，且3組間活性均有統計學差異(P＜0.05)，B、C、D組主動脈內膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達量比值均高于 E組(P＜0.05)，結果見圖1、表1。

圖1 5組小鼠主動脈內膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達量

表1 5組小鼠主動脈內膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達比較(±s)

表1 5組小鼠主動脈內膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達比較(±s)

注:A組:高脂飼料喂養;B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;E組:普通飼料喂養。與 E組比較，aP＜0.05;與 A組比較，cP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數 積分光密度值Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 10 0.531 ±0.034 0.731 ±0.024 0.643 ±0.076 A 組 10 1.078 ±0.053a 0.375 ±0.032a 2.713 ±0.052a B 組 10 0.931 ±0.042ac 0.463 ±0.012ac 2.232 ±0.064ac C 組 10 0.929 ±0.053ace 0.542 ±0.007ace 1.741 ±0.054ace D 組 10 0.632 ±0.131aceg0.613 ±0.031aceg0.843 ±0.041 E組aceg

2.4 Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達量關系Bax基因與Bcl-2基因mRNA水平的表達量之間為負相關關系(r= －0.635，P=0.036)。

2.5 血清TG濃度 A組血清中TG的濃度明顯高于 B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組血清中 TG 的濃度隨著維生素E劑量的增加逐漸降低，但B、C、D組間均有統計學差異(P＜0.05)，B、C、D組血清中TG的濃度均高于E組(P＜0.05)，結果見表2。

2.6 血清TC濃度 A組血清中TC的濃度明顯高于 B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組血清中 TC 的濃度隨著維生素E劑量的增加逐漸降低，但B、C、D組間均有統計學差異(P＜0.05)，B、C組血清中TG的濃度均高于E組(P＜0.05)，D組與E組間血清TG濃度無統計學差異(P＞0.05)，結果見表2。

表2 5組小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇濃度比較(±s，mmol/L)

表2 5組小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇濃度比較(±s，mmol/L)

注:A組:高脂飼料喂養;B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養;E組:普通飼料喂養。與 E組比較，aP＜0.05;與 A組比較，cP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數 甘油三酯 總膽固醇E組10 0.984 ±0.231 1.833 ±0.231 A 組 10 1.873 ±0.382a 3.153 ±0.873a B 組 10 1.743 ±0.231ac 2.127 ±0.732ac C 組 10 1.437 ±0.342ace 1.987 ±0.432ace D 組 10 1.288 ±0.126aceg 1.873 ±0.321aceg

3 討論

高脂血癥是影響動脈粥樣硬化的主要因素［6-9］，可在早期損傷內皮細胞，促進活性氧產生，增加細胞內氧化應激，破壞細胞結構與功能，誘導內皮細胞凋亡或壞死［10-12］。本實驗通過高脂飲食喂養4周成功誘導高脂血癥小鼠模型，主動脈Bax蛋白mRNA水平的表達量與Bax/Bcl-2明顯增高，而Bcl-2蛋白mRNA水平的表達量明顯降低，與E組比較高脂血癥組凋亡相關基因表達量明顯升高，表達高脂血癥可誘導血管內皮細胞凋亡，與李蓉［1］等所得的實驗結果相同。近年來大量研究表明高脂血癥導致血管內皮細胞凋亡主要是由于氧化應激反應所致，長期大劑量脂肪的攝入，體內會產生大量反應性氧類［13］。而維生素E可以有效的捕捉、清除超氧陰離子自由基、單線態氧和過氧化氫等，保護生物膜免受氧化損傷和過氧化損傷，增加機體對自由基的清除能力，是已被確認的自由基清除劑［14］。本實驗結果顯示，給予維生素E后Bax蛋白mRNA水平的表達量與Bax/Bcl-2均降低，而Bcl-2蛋白mRNA水平的表達量升高，血清TC與TG濃度均降低。

Bax基因發揮抑制凋亡的效應需要與其家族中Bcl-2基因相互協調，從而形成一個凋亡調控系統。當Bax同源二聚體形成，調控細胞對凋亡的易感性，決定細胞的存亡。Bax占優勢時細胞死亡，Bcl-2則阻止細胞死亡。Bax不僅與Bcl-2形成二聚體，還可以自身形成二聚體誘導凋亡，兩蛋白的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素［15］。Bcl-2可在細胞周期的任一階段抑制細胞凋亡［16-19］，抗凋亡的主要機制是:①作為抗氧化劑，調節細胞氧化還原狀態，阻斷氧化作用對細胞成分的破壞;②影響細胞跨膜轉運，改變鈣離子分布，鈣離子激活內源性內切酶和谷氨肽轉移酶;③抑制有促凋亡作用的細胞色素C從線粒體釋放到胞漿;④保護細胞，抑制DNA斷裂［20-23］。本實驗通過給予外源性維生素E后Bcl-2基因表達量增加，說明維生素E與Bcl-2基因有協同效應，共同對抗高脂血癥導致的氧化損傷。但是Bcl-2基因表達是通過何種途徑使血清TC、TG濃度降低還需我們在今后的科研與臨床工作中進一步探索。

本實驗進一步證實了高脂血癥可導致血管內皮細胞凋亡基因表達，而口服一定量的維生素E能降低其血清TG與TC的濃度，并降低凋亡基因的表達、升高抑制凋亡基因的表達，其具體機理還有待進一步研究，而維生素E這種安全可靠的保健藥物的使用為今后臨床工作中預防與治療高脂血癥導致的冠狀動脈粥樣硬化有著重要的指導意義。

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