反相高效液相色譜法測定燈盞細辛中燈盞乙素含量

聶朝霞

(湖南省衡陽市婦幼保健院藥劑科，湖南 衡陽 421001)

燈盞花素(Breviscapine)是從菊科短莛屬燈盞細辛中提取分離的黃酮類有效成分，主要成分為燈盞乙素(Scutellarin)，化學名為4’，5，6－三羥基－甲酮－7－葡萄糖醛酸苷，具有擴張微血管、增加動脈流量、降低血液黏度、減少外周阻力、抑制血小板聚集等作用[1]，臨床用于治療冠心病、心絞痛、心肌缺血損傷、血栓形成等[2]。本研究建立了燈盞細辛中燈盞乙素的分析方法，可作為燈盞細辛質量控制的方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國Waters公司，包括Waters2996二極管陣列檢測器，515型高壓泵，Waters717自動進樣器，Empower Pro色譜工作站);AllegraTM X－ZZR Centrifuge冷凍離心機(貝克曼公司);UV－260型紫外分光光度儀(日本島津公司);BA110S型電子分析天平(德國);KQ－300DE型數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。燈盞乙素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為842－200102);燈盞細辛藥材(湖南衡陽瑞源醫藥公司);甲醇為色譜純(美國Fishers公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇 －水(1∶1，1mol/L磷酸調節 pH至2.5);流速:1mL/min;檢測波長:335 nm;柱溫:35℃。進樣量:10μL。理論板數按燈盞乙素計算應不低于3 000，此條件下，燈盞乙素(tR=8.3min)與相臨色譜峰分離度大于1.5，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取燈盞乙素對照品8mg，置100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，得燈盞乙素標準貯備液(80μg/mL)，避光4℃冰箱保存，臨用時將貯備液用流動相稀釋至所需濃度，即得對照品溶液。精密稱取藥材粉末(過50目篩)0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入蒸餾水25mL，密塞，稱定質量，超聲處理(300W，40 kHz)45min，放冷，密塞，再稱定質量，用蒸餾水補足減失的質量，搖勻，濾過，以15 000 r/min的速度離心15min，精密量取續濾液1mL置10mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密吸取燈盞乙素對照品溶液(20μg/mL)0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mL 置 10mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件依次進樣10μL，測定。記錄峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標、質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=2.54 ×104X+612.86，r=0.999 9。結果表明，燈盞乙素質量濃度在0.25～8.00μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液的稀釋液(2.0μg/mL)，按擬訂色譜條件連續進樣5次。結果燈盞乙素峰面積的 RSD為0.59%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:精密稱取同一批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣6次，依法測定。結果燈盞乙素平均含量為 1.79 mg/g，RSD 為 0.99%(n=6)，表明該試驗重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，在擬訂色譜條件下，分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時進樣測定。結果燈盞乙素峰面積的 RSD 為0.82%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗:精密稱取已知燈盞乙素含量的藥材粉末9份，每份0.5 g，分別精密加入燈盞乙素對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進行含量測定，計算回收率。結果平均回收率為99.8%，RSD為1.1%(n=9)。

2.4 樣品含量測定

按2.2項下方法制備各不同來源的燈盞乙素的供試品溶液，按擬訂色譜條件進行反相高效液相色譜分析，按外標法計算各收集的燈盞細辛中燈盞乙素的百分含量，見表1。

表1 燈盞細辛中燈盞乙素含量測定結果

3 討論

根據測定目標表化合物燈盞乙素的理化性質和文獻，分別考察提取溶劑(95%乙醇、甲醇、水)、提取方式(回流、超聲提取)、溶劑量、提取時間，確定最佳提取條件為:以50倍量乙醇超聲提取45min。此方法簡便易行，燈盞乙素提取率最高，測定時干擾物質少。

根據文獻資料，參考燈盞乙素含量測定方法。選擇了3種色譜柱:Kromasil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5μm);Hypersil ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5 μm)色譜柱。分別選用 0.01% ，0.035% ，0.05% 的磷酸溶液與甲醇組成(甲醇－磷酸溶液=50∶50)3種流動相進行試驗比較，結果以甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)為流動相時分離度、燈盞乙素的峰形好，故選用甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)為流動相。流速為1.0mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為335 nm時，供試品中燈盞乙素得到了較好的分離，理論板數不低于3 000，分離度大于 1.5。

取一定量已知質量濃度的燈盞乙素對照品溶液，于190～700 nm波長范圍內掃描，結果在335 nm波長處有最大吸收，確定335nm為測定波長。

對不同產地的燈盞細辛樣品中燈盞乙素含量進行比較，發現不同的產地之間差異較大。這與楊生超等[3]的研究結果基本一致，可能在燈盞細辛的自然選擇過程中發生了遺傳分化有關。鑒于文獻報道燈盞細辛中燈盞乙素有較好改善心腦血管疾病的作用，故將燈盞乙素的含量作為藥材品質評價指標之一。本研究為燈盞細辛藥材及制劑質量控制提供了依據。

[1]程 英，陳 鑫，朱志安，等.燈盞花素對大鼠腦挫裂傷腦組織線粒體ATP酶活性及SOD和MDA水平的影響[J].上海中醫藥大學學報，2004，18(2):58 －60.

[2]陳新謙，金有豫.新編藥物學[M].第14版.北京:人民衛生出版社，1997:277.

[3]楊生超，張雪峰，李 黎，等.燈盞花種質資源燈盞乙素和咖啡酸醋含量[J].中國中藥雜志，2009，34(2):239 －240.