膽酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

楊昀，胡宇馳，周建平，曹春然

(北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035)

膽酸在水中溶解度較低(15℃時(shí)僅為0.28 g/L)，無法采用一般的家兔法進(jìn)行熱原項(xiàng)目檢查。鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)一般都是在水溶液中進(jìn)行，也無法直接用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解本品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢查。膽酸可溶于乙醇(15℃時(shí)在乙醇中的溶解度為30.56 g/L)，也溶于堿溶液，因此考慮以乙醇或堿性溶液為溶劑，將膽酸溶解后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。有研究將膽酸分別與1.0mol/L的NaOH溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水混合溶解，稀釋后制成質(zhì)量濃度為0.375 g/L的供試品溶液后再進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。但堿性溶液對(duì)于膽酸中可能含有的細(xì)菌內(nèi)毒素是否有干擾作用，尚無進(jìn)一步研究的資料。因此，本試驗(yàn)分別使用無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液分別溶解膽酸，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)研究;并采用外加細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，研究無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液溶解膽酸是否對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生干擾。

1 試驗(yàn)材料

膽酸原料，類白色粉末，3批樣品(New Zealand Pharmaceuticals Ltd.，批號(hào)分別為 0310107，0310108，0310109);鱟試劑(福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)為11110812，靈敏度為0.125EU/mL;批號(hào)為 12040612，靈敏度為 0.03 EU/mL，規(guī)格均為 0.1mL);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為1109071，靈敏度為0.25 EU/mL;批號(hào)為 1104211，靈敏度為 0.125 EU/mL，規(guī)格均為0.1mL);細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為150601－201072，規(guī)格為每支120 EU);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為201001，規(guī)格為每支10mL);無水乙醇(北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)為20111118)為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

按照2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定[1]，進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核，結(jié)果4批鱟試劑用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品檢查，λc均為 λ的0.5～2.0倍，表明鱟試劑的靈敏度均符合規(guī)定。

2.2 內(nèi)毒素限值(L)確定

膽酸為藥用輔料，內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的限值為360 EU/g。

2.3 膽酸有效稀釋濃度(MVC)

按公式 MVC=λ/L計(jì)算，其中L為膽酸的細(xì)菌內(nèi)毒素限值360 EU/g，λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常是 0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL。則對(duì)應(yīng)的膽酸有效稀釋質(zhì)量濃度分別為 1.39，0.69，0.35，0.17，0.087 g/L。

2.4 膽酸溶液制備

由于膽酸微溶于水，無法直接制備水溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)。但膽酸可溶于乙醇(15℃時(shí)在乙醇中的溶解度為30.56 g/L)，也溶于堿溶液，因此分別以無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液為溶劑，將膽酸溶解后再進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)試驗(yàn)。

2.5 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

2.5.1 無水乙醇處理

精密稱取膽酸140mg，加入無水乙醇5mL，超聲振蕩1min溶解制成膽酸貯備液。再將貯備液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，分別稀釋為 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，將此系列稀釋溶液記為NPC(此系列稀釋溶液中的乙醇濃度分別為5%，2.5%，1.25%，0.625% ，0.312 5%，以下均同)。

為驗(yàn)證經(jīng)無水乙醇處理和短時(shí)間超聲振蕩對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的影響，另精密稱取膽酸140mg，加入無水乙醇5mL，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品適量，超聲振蕩1min溶解，制成含有細(xì)菌內(nèi)毒素的膽酸貯備液。將上述貯備液稀釋成上述系列濃度，并使每一濃度的稀釋液中分別含有2λ及0.25λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此系列溶液分別記為PPC1和PPC2。

取靈敏度分別為0.25，0.125 EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液進(jìn)行反應(yīng);并以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水設(shè)立陽性和陰性對(duì)照，記為NC，依法進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果見表 1。可見，膽酸在 0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)及其以下稀釋濃度時(shí)對(duì)試驗(yàn)無干擾，且說明無水乙醇的處理和短時(shí)間內(nèi)的超聲振蕩在一定程度內(nèi)未對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

表1 膽酸干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(無水乙醇處理/0.1mol/LNaOH溶液處理)

2.5.2 1.0mol/LNaOH 溶液處理

精密稱取膽酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水9.2mL充分振蕩溶解，制成膽酸貯備液，據(jù)需要，調(diào)節(jié)膽酸貯備液pH在6～8之間。再將貯備液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋為 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，將此系列稀釋溶液記為NPC。

為驗(yàn)證經(jīng)1.0mol/LNaOH溶液處理對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的影響，另精密稱取膽酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水9.2mL及細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品適量，充分振蕩，制成含細(xì)菌內(nèi)毒素的膽酸貯備液。將上述貯備液稀釋成上述系列濃度，并使每一濃度的稀釋液中分別含有2λ及0.25λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此系列溶液分別記為PPC1和PPC2。

取靈敏度分別為0.25，0.125 EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液進(jìn)行反應(yīng);并以內(nèi)毒素檢查用水設(shè)立陽性和陰性對(duì)照，記為NC，依法進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果見表1。可見，經(jīng)1.0mol/LNaOH溶液處理膽酸后，細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)不成立。

2.6 正式干擾試驗(yàn)(無水乙醇處理)

根據(jù)表1兩種處理方法的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將3個(gè)批號(hào)的膽酸按2.5.1項(xiàng)下步驟處理后，取膽酸貯備液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別進(jìn)行稀釋，使其最終干擾試驗(yàn)稀釋質(zhì)量濃度為0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)，按2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗(yàn)項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，E s/E t均在0.5～2.0范圍內(nèi)，確認(rèn)膽酸經(jīng)無水乙醇處理后在0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)的稀釋質(zhì)量濃度下無干擾。

2.7 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

分別選擇靈敏度分別為0.03，0.125 EU/mL的兩個(gè)廠家的鱟試劑，按2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對(duì)上述3批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，均符合規(guī)定。結(jié)果見表3。

3 討論

膽酸微溶于水，因此無法采用一般的家兔法進(jìn)行熱原項(xiàng)目檢查;凝膠法為細(xì)菌內(nèi)毒素6種檢查方法中最簡(jiǎn)單和常用的方法，且為細(xì)菌內(nèi)毒素第一類檢查的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)方法[2]，因此建立膽酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法非常必要。但鱟試劑凝膠反應(yīng)一般是在水溶液中進(jìn)行，因此需要解決膽酸在水中溶解度較低的問題。

膽酸可溶于乙醇，也溶于堿性溶液，本試驗(yàn)分別采用這兩種溶劑進(jìn)行試驗(yàn)研究。一般情況下乙醇對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素有去除作用[3]。但另有文獻(xiàn)報(bào)道，60%的乙醇溶液及超聲對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的活性無明顯影響，乙醇濃度稀釋至4%～5%以下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的凝集反應(yīng)也無明顯干擾作用[4－5]。參照本試驗(yàn)結(jié)果，本研究將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品外加入膽酸原料中，并用無水乙醇和超聲振蕩進(jìn)行短暫處理，制成貯備液，并將貯備液進(jìn)一步稀釋制成供試品溶液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，無水乙醇短暫處理及短時(shí)間的超聲振蕩對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的活性無明顯影響。而且經(jīng)一系列稀釋后，最終進(jìn)行鱟試劑凝膠反應(yīng)的供試品溶液中所含的乙醇濃度為5%及其以下濃度，對(duì)鱟試劑的凝集反應(yīng)也未產(chǎn)生明顯干擾作用。

在膽酸中預(yù)先外加細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品后再使用1.0mol/L NaOH溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，干擾預(yù)試驗(yàn)不成立。此時(shí)溶液的pH在8～9之間，推測(cè)并非是pH對(duì)鱟試劑的凝集產(chǎn)生干擾。另取膽酸按擬訂方法溶解后再外加細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，干擾消失，干擾預(yù)試驗(yàn)成立。由此推測(cè)1.0mol/LNaOH溶液溶解膽酸，發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，其反應(yīng)過程對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生影響，造成干擾試驗(yàn)不成立。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅪE[1]要求，應(yīng)使用預(yù)先添加標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。因此，使用1.0mol/LNaOH溶液溶解膽酸的方法不適用于膽酸的細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢查。

由于鱟試劑生產(chǎn)廠家不同，工藝不同，對(duì)供試品的抗干擾能力不同，故應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的試驗(yàn)材料。

表2 膽酸(無水乙醇處理)正式干擾試驗(yàn)結(jié)果

表3 膽酸(無水乙醇處理)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

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