竹節參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬GFAP、GAP－43表達的影響

王 敏 張秋霞 鄒海艷 趙 暉 李 佳

(首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069)

竹節參是五加科植物竹節參(Panax Japonicus C.A Meyer)根莖，為國家珍稀名貴藥材。本實驗室前期研究發現竹節參的主要活性部位－竹節參總皂苷(Total Saponins of Panax japonicus，TSPJ)可以改善慢性腦缺血大鼠學習記憶能力［1］。為進一步探討藥物作用的機制，本研究擬觀察竹節參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬腦區星形膠質細胞增生和生長相關蛋白GAP－43表達的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質重280～300g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［合格證號SCXK(京)2006－0009］。飼養在首都醫科大學實驗動物中心［許可證號SYXK(京)2005－0022］。12h光照/黑暗周期，環境溫度(22±1)℃。動物自由進食進水，適應3天后正式進行實驗。

1.2 藥物 竹節參藥材，購于湖北，由首都醫科大學李佳副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節參(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根莖。TSPJ得率9.58%，由首都醫科大學中醫藥學院中藥化學實驗室提供，為淡黃色粉末(批號:20080707)，臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.3 試劑 兔抗鼠GFAP單克隆抗體、兔抗鼠GAP－43單克隆抗體羊抗兔IgG均購自Epitomics公司;抗β－Actin兔多克隆抗體、Tis－組織蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.4 儀器 BIO－RAP MODEL 680型酶標儀，北京元業伯樂科技發展有限公司;垂直電泳槽，美國BIORAD公司;穩壓穩流電泳儀/電轉儀，美國BIO－RAD公司生產。

2 實驗方法

2.1 動物分組 60只SD雄性大鼠體重(280～300g)，用隨機數字表方法將實驗動物隨機分為4組，即假手術組、模型組、TSPJ組(200、100mg·kg－1)，每組10只動物。

2.2 模型制備 參考文獻方法［2］，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥固定，頸前部正中切口，分離雙側頸總動脈，進行永久性結扎，縫合傷口。假手術組大鼠僅游離雙側頸總動脈后縫合傷口，各組大鼠同條件飼養。

2.3 給藥 造模24h開始給藥，每日1次，連續給藥30天后進行各項指標檢測。假手術組及模型組動物灌胃給等容量生理鹽水。

2.4 海馬GFAP GAP－43蛋白檢測 動物，斷頭處死，迅速在冰盒中分離海馬組織，放置液氮;Tis－蛋白抽提試劑抽提海馬組織蛋白，BCA法蛋白定量;10%的SDS－PAGE凝膠電泳，上樣量為10μg，電泳結束后，進行蛋白質轉膜;與GAP－43一抗(1:100 00)、GFAP一抗(1:200 00)雜交反應;再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1:100 00)雜交反應1h，在暗室進行X－光膠片曝光、顯影和定影。然后用同一張NC膜與內參GAPDH(1:100 00)進行雜交反應。采用YLN－2000凝膠影像分析系統分析目的條帶，目的蛋白吸光度值和內參蛋白吸光度值的比值，作為目的蛋白表達的相對水平。

2.5 統計方法 運用SPSS 10.0進行方差分析，LSD檢驗比較兩組間差異。結果以(s)表示。

3 結果

Western blot結果顯示，慢性腦缺血30天大鼠海馬GFAP表達明顯上調(P＜0.01);TRPJS能明顯上調海馬GAP－43蛋白的表達，下調海馬GFAP蛋白的表達，與模型組差異顯著(P＜0.01)。

表1 各組大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的相對表達量(s，n=5)

表1 各組大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的相對表達量(s，n=5)

注:與模型組相比，＊＊P ＜0.01。

GAP－43/GAPDH GFAP/GAPDH假手術組 － 0.85±0.10 0.93±0.10分組 劑量/mg·kg－1＊＊模型組 － 0.74±0.16 1.83±0.11 TSPJ 100 1.02±0.14＊＊ 1.22±0.21＊＊TSPJ 200 1.13±0.16＊＊ 0.96±0.32＊＊

圖1 Western blot檢測大鼠海馬GAP－43、GFAP蛋白的表達

4 討論

突觸可塑性是學習記憶的重要神經基礎，海馬直接參與信息貯存和回憶，是腦內參與記憶貯存功能的重要部分，慢性腦缺血可損害海馬突觸可塑性引起學習記憶能力下降［3］。GAP－43對新突觸形成及功能完善具有顯著的調控作用［4］。成年大部分腦區GAP－43表達水平較低，新皮質、嗅球和海馬GAP－43mRNA一直保持在較高水平。損傷時，這些區域的神經元都表現為側枝出芽和反應性軸突再生，并伴隨著GAP－43表達增高，這是機體自我修復的一種正常反應［5］。本次實驗中，我們觀察到慢性腦缺血30天后，海馬GAP－43的表達較假手術組有降低趨勢，結果提示，機體內源性修復能力有限，GAP－43的表達會隨著缺血時間的延長而逐步降低。星形膠質細胞在節突觸可塑性及突觸功能活動中發揮著關鍵性作用［6］。GFAP作為星形膠質細胞的特異性標志蛋白，是星形膠質細胞活化及增殖的標志物之一，腦缺血后海馬出現的過度增殖的膠質細胞以及膠質疤痕的形成不僅影響到正常的局部神經回路，而且可能是繼發癲癇以及認知功能損害的重要因素［7］。因此調節GAP－43表達，有效抑制星形膠質細胞的過度增殖，防止膠質疤痕的形成是腦保護的研究重點。

竹節參是五加科植物竹節參Panax Japonicus C.A Meyer根莖，為國家珍稀名貴藥材。早在清代《綱目拾遺》中有載，稱其為“血癥良藥”。竹節參與人參和三七是同科同屬的植物，目前的研究認為，皂苷是人參屬植物的主要有效成分。竹節參的化學研究證實竹節參中的皂苷既有齊墩果烷型五環三萜皂苷，也有在人參和三七中活性最顯著的達瑪烷型四環三萜皂苷以及甾體皂苷。本實驗室前期研究工作發現——竹節參的有效活性部位，總皂苷對多種腦缺血模型有很好的保護作用，能夠改善腦缺血動物的神經功能癥狀和血液流變學指標，減輕腦組織病理形態學改變，同時能夠提高擬血管癡呆模型動物的學習記憶能力［8－10］，本次研究發現竹節參總皂苷可上調慢性腦缺血大鼠海馬神經生長相關蛋白GAP－43的表達，降低海馬星形膠質細胞的增生有一定的相關性。

［1］趙暉，王蕾，張秋霞，等.竹節參總皂苷對血管癡呆大鼠遞質氨基酸及自由基代謝的影響［J］.中國老年學雜志，2010，11(30):3096－3098.

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［10］趙暉，李佳，穆陽.竹節參總皂苷對中動脈栓塞模型大鼠血液流變學的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2006，13(11):33.