RNAi沉默Stat1基因對膠質瘤細胞FAT10表達的影響

李少一 王志超 高 蕓 李曉東 張明杰 馬維寧 劉云會

(中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科，遼寧 沈陽 110041)

1996年，FAT10在人類的Ⅰ類主要組織相容性復合體(MHCⅠ類)區域被發現〔1〕，此后FAT10被報道與肝癌的發生密切相關，在90%以上的肝癌過表達，而在毗鄰的非肝癌組織中FAT10在轉錄水平和蛋白水平均檢測不到〔2〕。近期的研究顯示，FAT10在膠質瘤中也存在過表達現象〔3〕，并與膠質瘤的進展與預后不良密切相關，在老年人群中尤為明顯。FAT10，又稱雙泛素，由165個氨基酸殘基組成，分子量18 kD，屬于泛素蛋白家族中的泛素樣修飾蛋白(UBLs)，由兩個泛素樣部分前后融合而成〔4，5〕。FAT10的功能涉及很多方面，包括信號轉導、蛋白移位和細胞周期調節等。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基、OPTI培養基、胎牛血清，購自Invitrogen公司，RIPA細胞裂解液購自北京百泰克生物科技公司，FAT10、Stat1單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗鼠IgG抗體購自Pierce公司，Stat1 siRNA購自Sigma公司。人膠質瘤細胞株U251購自ATCC公司。

1.2 序列分析 FAT10轉錄起始點上游的啟動子及其上游調控區的2 500bp序列從ENSEMBL數據庫(http://www.ensembl.org/)下載，采用 TRANSFAC數據庫(Version 8.3)在線預測FAT10基因上游調控序列的(http://alggen.lsi.upc.es/)轉錄因子結合位點。

1.3 電穿孔轉染 離心收集細胞，重懸細胞于OPTI培養基中，調整細胞密度至1×107細胞/ml，加入1 μg的Stat1 siRNA混勻后移入2 mm電轉杯，電擊條件為120 V，20 ms，將細胞分3份轉入6孔培養板放入培養箱培養，用于后續實驗。

1.4 細胞TNF-α處理 Stat1干擾組及陰性對照組電穿孔轉染24 h后，給予50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后收集細胞用于Western印跡檢測。而核型分析實驗中，經電穿孔轉染24 h和50 ng/ml的TNF-α刺激8 h后，更換為普通培養液，2 d后重復進行電穿孔和TNF-α刺激，重復5次后收集細胞進行核型分析。

1.5 Western印跡檢測 用RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，變性處理后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入單抗4℃過夜后，再加1∶1 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育30 min，經PBST清洗3次，ECL發光顯影。

1.6 核型分析 收集各組細胞，經0.075 mol/L的KCl室溫下低滲30 min處理后，用新配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)于-20℃固定2 h，采用冷片法滴片，空氣干燥過夜。干燥后的染色體玻片用Giemsa染液染色10 min，選取50個染色體中期分裂相進行染色體計數。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件分析數據。

2 結果

2.1 FAT10基因啟動子區的炎性轉錄因子結合位點的預測采用生物學軟件預測了FAT10基因-2 500～+250區段，核因子(NF)-κB、Stat1、Stat3炎性轉錄因子的結合位點。結果見圖1，其中NF-κB結合位點7個，Stat1結合位點7個，Stat3結合位點3個。

圖3 核型分析

圖1 FAT10上游－2 500～+250區段假定炎性因子結合位點

2.2 Stat1小干擾RNA沉默效率及FAT10蛋白水平檢測Western印跡結果顯示，經TNF-α刺激后FAT10蛋白表達量升高明顯。與陰性對照組(si Ctr)和空白對照組比較，Stat1干擾組(si Stat1)Stat1的蛋白表達水平下降，說明進行siRNA干擾后，有效抑制了U251細胞中Stat1的表達。而TNF-α誘導的FAT10高表達，在Stat1干擾組也明顯降低，表明通過抑制Stat1可以有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達。見圖2。

2.3 核型分析 對各組處理細胞的中期分裂相染色體的觀察表明:對照組U251細胞(Ctr)正常二倍體染色體數目為60～69，占計數細胞總數的85%;而經過TNF-α處理后的U251細胞(TNF-α/si Ctr)的正常二倍體染色體比例下降到37.5%(與對照組比較有顯著差異，P＜0.01);而Stat siRNA干擾組U251細胞(TNF-α/si Stat1)正常二倍體染色體比例接近對照組，為80%(與TNF-α處理組比較有顯著差異，P＜0.01)。見圖3。結果提示，TNF-α可以誘導非整倍體的出現，而采用si Stat1沉默Stat1后，可以通過有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達而阻斷TNF-α誘導的U251細胞的核型異常。

3 討論

現代細胞遺傳學和分子生物學研究證明，大多數腫瘤細胞特別是實體瘤細胞核體外轉化細胞，常表現為染色體不穩定(CIN)，非整倍體是主要表現形式之一，即整條染色體的獲得或者缺失。Duesberg研究發現，非整倍體的出現，可以通過破壞細胞周期檢測點和平衡機制，導致細胞癌變〔6，7〕。

FAT10作為類泛素家族成員，被發現在肝癌、膠質瘤、大腸癌等惡性腫瘤中表達增高〔2，3，8〕，但在肝癌的發生發展中起著重要作用，但具體作用機制還不很清楚。FAT10作為重要炎性因子TNF-α下游因子，有報道顯示，FAT10通過與MAD2(mitotic arrest deficient 2)非共價結合〔2，4〕，導致染色體不穩定。MAD2是保證染色體向兩極移動的重要的物質基礎，其在著絲粒上的缺乏，可能導致部分染色體分離異常〔9〕。在細胞有絲分裂的前、中期，高表達的FAT10可以降低定位在著絲粒上的MAD2，導致染色體不分離和染色體不穩定，出現非整倍體細胞。本研究結果顯示，siRNA干擾有效抑制U251細胞中Stat1的表達后，可以通過抑制Stat1有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達，進而通過有效抑制TNF-α誘導的FAT10高表達而阻斷TNF-α誘導的非整倍體現象。FAT10作為重要炎性因子TNF-α下游因子，具有參與慢性炎癥相關性腫瘤發生發展的潛能，解析TNF-α/NF-κB/FAT10路徑調控肝癌發生發展進程的分子機制，有助于進一步尋找有效的膠質瘤治療靶標。

圖2 Stat1和FAT10的蛋白表達結果

1 Fan W，Cai W，Parimoo S，et al.Identification of seven new human MHC class I region genes around the HLA-F locus〔J〕.Immunogenetics，1996;44(2):97-103.

2 Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al.Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gastrointestinal and gynecological cancers〔J〕.Oncogene，2003;22(17):2592-603.

3 Yuan J，Tu Y，Mao X，et al.Increased expression of FAT10 is correlated with progression and prognosis of human glioma〔J〕.Pathol Oncol Res，2012;18(4):833-9.

4 Ren J，Kan A，Leong SH，et al.FA10 plays a role in the regulation of chromosomal stability〔J〕.J Biol Chem，2006;281(16):11413-21.

5 Pierron R.Magnetic resonance imaging in the evaluation of knee injuries〔J〕.South Med J，1992;85(7):783.

6 Sch?fer M，Werner S.Cancer as an overhealing wound:an old hypothesis revisited〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2008;9(8):628-38.

7 Li R，Sonik A，Stindl R，et al.Aneuploidy vs.gene mutation hypothesis of cancer:recent study claims mutation but is found to support aneuploidy〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(7):3236-41.

8 Lukasiak S，Schiller C，Oehlschlaeger P，et al.Proinflammatory cytokines cause FAT10 upregulation in cancers of liver and colon〔J〕.Oncogene，2008;27(46):6068-74.

9 Wang X，Jin DY，Wong YC，et al.Correlation of defective mitotic checkpoint with aberrantly reduced expression of MAD2 protein in nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Carcinogenesis，2000;21(12):2293-7.