沙棘葉水提物對小鼠非特異免疫功能的影響及抗凝血作用

屈長青 丁計銀 王新魯 姬云濤 (阜陽師范學院生命科學學院，安徽 阜陽 23604)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木、喬木或小喬木。別名黑刺、醋柳、酸刺。沙棘富含多種生物活性物質(zhì)，具有多種藥理功能〔1〕。沙棘黃酮是沙棘中一種重要的有效成分，沙棘葉和種子中總黃酮的含量高于果實，而且黃酮在降低血清膽固醇、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖顾ダ稀⒖馆椛洹⒖寡住⒖共《尽⒖剐募∪毖⒖剐乃ァ⒖剐穆适С５确矫嬗忻黠@藥理功效〔2，3〕。沙棘黃酮在治療和緩解人類的某些疾病，如高血糖、高脂血癥、心力衰竭及抑制血小板凝聚等方面具有明顯的作用〔4～6〕。本實驗旨在研究沙棘葉水提物對機體非特異性免疫功能和抗凝血作用的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙棘葉，新疆清河縣隆豪發(fā)展有限公司提供;雞血(菜市場新鮮雞血);0.1%蛋白胨溶液;肝素鈉;白細胞稀釋液(冰醋酸1.5 ml、1%龍膽紫1 ml、加蒸餾水至100 ml);瑞氏染液;阿氏液(葡萄糖 2.05 g、枸櫞酸鈉0.8 g、檸檬酸0.055 g、氯化鈉0.42 g、加蒸餾水至100 ml，加熱溶解后將pH值調(diào)到6.1，經(jīng)69 kPa、15 min的高壓滅菌，放置在4℃的環(huán)境內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?

1.2 動物及儀器 健康昆明種小白鼠8只，體質(zhì)量18～22 g，由胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室提供。電子天平(上海精密科學有限公司);XMTD-8222烘箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);LEICA DM1000正置熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉水提物的制備 取沙棘葉葉15 g，加入蒸餾水至600 ml，浸泡 1 h，煎煮 50 min，過濾，殘渣再加水，煎煮30 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮為500 mg/ml，4℃保存。用500 mg/ml沙棘葉水提物濃液配制成低、中、高劑量即10、20、30 mg/ml的溶液。

1.3.2 小鼠的分組和給藥 小鼠分4組每組6只，分別按高、中和低劑量灌胃，對照組給予生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。

1.3.3 斷尾法測量小鼠的出血時間 末次給藥1 h后，固定小鼠，在距離尾端1.5 mm處將其剪斷，待血液流出時開始計時，并每隔30 s用吸水紙吸取血液一次，直至用吸水紙吸取時沒有血液為止，此段時間即為小鼠的出血時間。

1.3.4 玻片法測量小鼠凝血時間 末次給藥1 h后，在距離小鼠尾端5 mm處斷尾，在斷尾前盡可能地按摩小鼠尾部，從尾端到尾根，取干凈的玻片，分別在玻片的兩端滴一滴小鼠血液，自血液流出后開始計時，隨后每隔30 s用針頭挑撥血液，至能夠挑出纖維狀蛋白時停下，此段時間即為小鼠的凝血時間〔7，8〕。

1.3.5 小鼠白細胞數(shù)的測量 末次給藥2 h后，在尾部取血20 μl，置于 380 μl的白細胞稀釋液中，混勻后計數(shù)。

1.3.6 脾指數(shù)和胸腺指數(shù)測定 實驗前稱量小鼠體重，之后在做腹腔巨噬細胞吞噬試驗的同時，剖取小鼠的脾和胸腺，用濾紙吸干殘血后，稱鮮重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.7 腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù) 實驗前3 d，每天向小鼠腹腔注射1%的蛋白胨溶液，末次注射24 h后，再向小鼠腹腔注射1%的雞紅血細胞懸液1 ml，隨即輕輕按摩小鼠腹部，30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，取其腹腔液做成涂片，稍干后，用瑞氏染液濃染2 min，加入等量蒸餾水淡染13 min，水洗后鏡檢觀察記錄。根據(jù)倒置顯微鏡觀察，按文獻〔9〕，計算吞噬百分率與吞噬指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 沙棘葉水提物對小鼠斷尾出血時間的影響 與對照組出血時間〔(2 640±268.328)s〕相比，不同劑量的沙棘葉水提物具有明顯的抗凝血作用，高劑量與中、低劑量差異顯著〔(52.30±177.482)、(4 512 ±269.665)、(4 308 ±79.145)s，P ＜0.01〕。

2.2 沙棘葉水提物對小鼠凝血時間的影響 連續(xù)給藥10 d后，沙棘葉水提物能明顯延長小鼠血液的凝血時間，高、中、低劑量組與對照組相比差異顯著〔(1 139.8±25.675)、(923.2±18.185)、(787.2 ±12.872)、(697.0 ±21.926)s，P ＜0.05〕。

2.3 沙棘葉水提物對小鼠白細胞數(shù)量的影響 與對照組小鼠白細胞數(shù)量〔(555.4±299.078)個/ml〕相比，高、中、低劑量沙棘葉水提物組小鼠體內(nèi)白細胞數(shù)目明顯增多〔(7 869.0±173.940)、(10 045.0 ±880.057)、(6 012.6 ±205.946)個/ml，P＜0.05〕，中劑量組與高、低劑量組比較差異顯著。

2.4 沙棘葉水提物對小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 高、中劑量組小鼠脾指數(shù)明顯增高，中劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著增高(P ＜0.05，P ＜0.01)。見表1。

2.5 沙棘葉水提物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響 與對照組相比，實驗組都能明顯提高小鼠的巨噬細胞功能，中劑量組與高、低劑量組差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表1 沙棘葉水提物對小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(s，n=6，mg/g)

表1 沙棘葉水提物對小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(s，n=6，mg/g)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

組別 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)對照組2.304±0.030 5 2.964±0.093 2.204±0.028 2低劑量 3.052±0.087 2.300±0.031 6中劑量 3.390±0.0432) 2.520±0.033 91)高劑量 3.170±0.0372)

表2 沙棘葉水提物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響(s，n=6，%)

表2 沙棘葉水提物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響(s，n=6，%)

組別 吞噬率 吞噬指數(shù)對照組42.0±4.123 55.6±5.079低劑量 50.2±3.1151) 63.2±3.3471)中劑量 56.6±2.9662) 75.4±6.0952)高劑量 51.8±3.342) 65.2±4.1482)

3 討論

細胞免疫是機體抵抗細胞內(nèi)微生物(如病毒)和宿主細胞內(nèi)增生的細菌感染的防御機制。白細胞數(shù)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為判斷身體免疫功能強弱的指標。本實驗表明，不同劑量的沙棘葉水提物和對照組比較能夠明顯增加白細胞的數(shù)目，中劑量效果顯著;同時也對小鼠脾臟和胸腺有明顯的增重效果，中劑量組脾、胸腺增重較多，指數(shù)較大。這與鐘飛等〔10〕給小鼠腹腔注射沙棘總黃酮，能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的結(jié)果一致。

腹腔巨噬細胞具有高度的吞噬能力，擔負機體非特異性免疫的防御機能，具有參與調(diào)節(jié)免疫應答的功能。巨噬細胞的吞噬實驗被用作衡量機體免疫功能的一項重要指標。韓春卉等〔11〕發(fā)現(xiàn)，沙棘油可明顯增強小鼠NK細胞活性、提高小鼠的單核-巨噬細胞吞噬功能。本實驗證明不同劑量組的沙棘葉水提物也可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。在抗凝血方面，本實驗也證明沙棘葉水提物有延長小鼠的出血時間，抑制體內(nèi)外血栓的形成，可顯著降低小白鼠血小板黏附率，起到抗凝血的功效。

沙棘葉和種子中總黃酮的含量高于果實，黃酮在降低血清膽固醇、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖顾ダ稀⒖馆椛洹⒖寡住⒌确矫嬗忻黠@藥理功效。本實驗進一步研究了沙棘葉水提物對機體非特異性免疫功能和抗凝血作用的影響，為沙棘葉的藥用價值和食用價值提供了實驗依據(jù)，但其機制有待于深入研究。

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