Klotho基因多態(tài)性與高血壓左室肥厚的關(guān)系

李 龍 李 莉 崔天祥 趙 狄 (鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

Kuro-o等〔1〕在1997年研究自發(fā)性高血壓大鼠時偶然發(fā)現(xiàn)了一個與人類衰老相關(guān)的基因——klotho基因，以后確認klotho基因缺失鼠(kl-/-)的表型類似人類的衰老表現(xiàn)，包括血壓升高、壽命縮短、動脈硬化、內(nèi)皮功能障礙、肌肉萎縮、認知障礙、骨質(zhì)疏松等。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，klotho基因的表達量逐漸降低，高血壓患病率逐漸升高〔2〕，二者之間可能存在相關(guān)。Rhee等〔3〕發(fā)現(xiàn)klotho基因啟動子G395A多態(tài)性影響klotho蛋白表達。血漿klotho蛋白水平降低易導(dǎo)致高血壓早期腎損害及高血壓腦損害，但klotoh基因與高血壓左室肥厚的關(guān)系尚未見文獻報道。本文旨在探討klotho基因G395A多態(tài)性與高血壓合并左室肥厚的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 來自于2012年1～8月在鄭州大學第二附屬醫(yī)院門診及住院的原發(fā)性高血壓患者，診斷標準按照2010年中國高血壓防治指南。所有患者均排除繼發(fā)性高血壓、腦血管病、糖尿病、泌尿系統(tǒng)感染及肝腎功能不全等，且采血前均停用降壓藥物2 w。根據(jù)高血壓患者是否合并左室肥厚，將其分為單純高血壓組(A組，76例)，高血壓合并左室肥厚組(B組，82例)。69例健康成人為對照組(C組)。各組臨床資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 左室肥厚診斷依據(jù) 采用東芝240型彩色多普勒超聲儀，由同一操作者按美國超聲協(xié)會推薦的測量方法，連續(xù)測量3個心動周期的左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、舒張期左室壁厚度(PWT)及舒張期室間隔厚度(IVST)，取其平均值。體表面積(BSA)=〔0.006×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)〕-0.152 9。左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)根據(jù)Devereux公式計算，即LVMI(g/m2)={0.8 ×1.04〔(LVDd+IVST+PWT)3-LVDd3〕+0.6}/BSA。符合以下一項以上標準者為LVH:(1)PWT≥12 mm;(2)IVST≥12 mm;(3)LVMI男性 ＞125 g/m2，女性＞120 g/m2。

1.2.2 標本采集 所有研究對象空腹12 h以上，采集清晨靜脈血5 ml入EDTA抗凝管中，離心10 min(2 000 r/min)，取血漿，-70℃保存。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測 DNA提取:采用常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA，提取試劑盒由大連寶生物工程有限公司提供。引物設(shè)計:通過美國國家生物信息中心的GenBank獲取基因序列及相應(yīng)位點的SNP信息。采用Primer5.0軟件自行設(shè)計等位基因特異性引物。設(shè)計一條等位基因特異性上游引物，同時設(shè)計一條3'末端堿基與檢測SNP位點的突變型或野生型等位基因堿基互補的下游引物即等位基因特異性下游引物。Klotho基因 G395A上游引物::5'-AATCGGCTCCAGCAATGTCCAG-3'，Tm 60.0℃，GC(%)54.5%;下游引物:如果為G等位基因5'-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTC-3'，Tm 58.4℃，GC(%)47.8%;如果為 A 等位基因 5'-GAGAAAAGGCGACGACCATCTTTT-3'，Tm 58.7℃，GC(%)45.8%。設(shè)計引物均由中國大連寶生物技術(shù)有限公司合成。PCR采用 20 μl反應(yīng)體系，其中 10 倍緩沖液 2 μl，dNTP 0.125 μmol/L，MgCl22.0 mmol/L，引物濃度為 0.25 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 IU，Templet DNA 100 ng。反應(yīng)條件為:G等位基因94℃ 5 min預(yù)變性，94℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃延長10 min;A等位基因94℃5 min 預(yù)變性，94℃變性 30 s、61℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 30 s，共35個循環(huán)，72℃延長10 min。取PCR產(chǎn)物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠-溴乙錠染色法電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀測并記錄結(jié)果。Klotho基因G395A多態(tài)性等位基因型為AA、GA、GG三種形式;其PCR擴增產(chǎn)物片段長147 bp。

1.2.4 生化指標檢測 采用日立7600全自動生化分析儀測定血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)等生化指標。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行處理，用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗樣本的群體代表性;計量資料以±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗。各組基因型及等位基因比較采用χ2檢驗及χ2分割檢驗，采用Pearson分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較 三組間性別、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、TG、Scr比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 三組klotho基因G395A位點多態(tài)性分析 本研究三組klotho基因型分布符合Haldy-Weinberg平衡。三組間Klotho基因G395A位點的多態(tài)性分布頻率有顯著差異(χ2=16.976，P＜0.05)。單純高血壓組和對照組的基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，A等位基因頻率高于對照組(χ2=3.863，P＜0.05)。高血壓合并左室肥厚組和對照組的基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.307，P＜0.05)，A等位基因頻率高于對照組(χ2=16.314，P＜0.05)。單純高血壓組和高血壓合并左室肥厚組基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.586，P＜0.05)。見表2。

表1 研究對象一般情況比較(±s)

表1 研究對象一般情況比較(±s)

項目 A組(n=76) B組(n=82) C組(n=69)40/36 44/38 38/31 TC(mmol/L) 4.74±1.03 4.79±1.05 4.69±0.99 LDL-C(mmol/L) 3.09±1.05 3.15±1.03 3.07±1.09 HDL-C(mmol/L) 1.25±0.35 1.23±0.37 1.26±0.38 FPG(mmol/L) 5.59±1.87 5.24±1.99 5.47±2.01 TG(mmol/L) 1.67±1.08 1.65±1.15 1.76±1.26 Scr(μmol/L)性別(男/女)87.98±7.05 92.45±6.78 94.67±7.42

表2 三組基因型及等位基因分布〔n(%)〕

3 討論

Klotho基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個抗衰老基因，人和小鼠的klotho基因位于染色體13q12區(qū)域，大鼠位于12q12區(qū)域〔4〕。Klotho基因在人體內(nèi)編碼的蛋白分為膜結(jié)合型蛋白和分泌型蛋白兩種，分泌型蛋白的表達量明顯高于膜型蛋白。Saito等〔5〕利用腺病毒介導(dǎo)將klotho基因?qū)雱用}粥樣硬化模型鼠(OLETF)體內(nèi)(伴有高血壓、高血脂、高血糖、肥胖)，發(fā)現(xiàn)klotho基因可改善血管內(nèi)皮功能，增加一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，降低血壓，防止內(nèi)膜增厚和血管纖維化。血漿NO水平隨著klotho蛋白濃度的升高而增加，兩者存在正相關(guān)。

近年來klotho基因G395A位點多態(tài)性與高血壓的關(guān)系倍受關(guān)注。Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)klotho G395A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)該位點的基因突變可能是該基因表達的一種潛在調(diào)節(jié)靶點。Rhee等〔7〕在研究韓國女性G395A位點基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者的收縮壓明顯高于非A等位基因攜帶者，且經(jīng)過體重指數(shù)、年齡校正后仍有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓組A等位基因頻率高于對照組，提示klotoh基因G395A多態(tài)性可能與原發(fā)性高血壓的發(fā)生有關(guān)，AA基因型可能易患高血壓，A等位基因可能是高血壓的易感基因，本研究與Rhee等〔7〕的研究結(jié)果相符。單純高血壓組G等位基因頻率高于高血壓左室肥厚組，提示G等位基因可能對高血壓左室肥厚的發(fā)生具有保護作用。總之，Klotho基因G395A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓及左室肥厚的發(fā)生有關(guān)，改變G395A位點的表達能否減少高血壓、左室肥厚的發(fā)生及其作用機制有待進一步研究。

1 Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa，H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature，1997;390(6655):45-51.

2 Ong KL，Cheung.BMY，Man YB，et al.Prevalence，awareness，treatment and control of hypertension among United States adults 1994-2004〔J〕.Hypertension，2007;49(1):69-75.

3 Rhee EJ，Oh KW，Yun EJ，et al.Relationship between polymorphisms G395A in promoter and C1818T in exon 4 of the Klotho gene with glucose metabolism and cardiovascular risk factors in Korean women〔J〕.J Endocrinol Invest，2006;29:613-8.

4 Matsumura Y，Aizawa H，Shiraki-Iida T，et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;242(3):626-30.

5 Saito Y，Nakamura T，Ohyama Y，et al.In vivo klotho gene delivery protects against endothelial dysfunction in multiple risk factor syndrome〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;276(2):767-72.

6 Wang HL，Xu Q，Wang Z，et al.Potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population〔J〕.Clin Chim Acta，2010;411(5-6):386-90.

7 Rhee EJ，Oh KW，Lee WY，et al.The differential effects of age on the association of Klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism，2006;55:1344-51.