TS、TOPO-Ⅰ、ERCC1基因在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

姜梅玲 劉玉龍 李 元 卞華慧 陳煒博 王優優 張 英 孔雪源

(蘇州大學附屬第二醫院，江蘇 蘇州 215004)

化療為中晚期結直腸癌的主要治療方法，化療的主要藥物為氟尿嘧啶類、喜樹堿衍生物類、鉑類及分子靶向類藥物。相關研究表明〔1～4〕，TS、TOPO-I、ERCC1 蛋白表達情況可以預測化療藥物的療效及毒副反應，化療前通過檢測TS、TOPO-I、ERCC1蛋白或基因多態性的表達，制定合理的化療方案，有利于提高治療的療效，延長患者生存期，提高生活質量。本研究檢測了結直腸癌患者腫瘤組織中TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達情況，并探討其與結直腸癌臨床病理學特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本取自術后腫瘤組織的石蠟塊或活檢后甲醛溶液固定組織。均經病理診斷證實。術前或活檢前未行任何放、化療。

1.2 臨床資料 2011年1月至2012年7月在我院住院的111例結直腸癌患者中男性61例，女性50例;年齡28～81歲，中位年齡54.5歲;結腸癌52例，直腸癌59例;T分期:T1+T2 14例，T3+T4 97例;淋巴結轉移情況:N0 10例，N1 73例，N2 28例;腫瘤分化程度:高分化10例，中分化76例，低分化24例，未分化1例。

1.3 實驗試劑 S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。TS抗體(稀釋比例:1∶100)購自福建邁新公司。TOPO-I、ERCC1抗體(稀釋比例:1∶100)購自北京中衫公司。

1.4 實驗方法 免疫組化染色法采用SP法檢測TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達。常規脫蠟、乙醇梯度水化，枸櫞酸鹽抗原熱修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，37℃ 10 min，滴加一抗(TS、TOPO-I、ERCC1，1∶50)，4℃過夜，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，后再滴加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，DAB顯色3～10 min，蘇木素復染、脫水、透明。中性樹膠封片后鏡下觀察，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性片做陽性對照。

1.5 免疫組化結果判斷標準 由2名未參與實驗研究、不了解患者臨床資料的病理醫生分別獨立觀察所有切片。遇結果不一致時，由2人協商決定。以細胞質和(或)細胞核膜出現棕紅色顆粒為陽性，隨機取5個高倍視野，TS、ERCC1按細胞核和細胞質顯色深淺計分，無陽性反應細胞為0分，淺紅色為1分，棕紅色為2分，棕褐色為3分。0～1分判斷為低表達(+)，2分判斷為中表達(?)，3分判斷為高表達(?)。TOPO-I按細胞核著色程度評判，＜10%為低表達，10% ～50%為中表達，＞50%為高表達。

1.6 近期療效和生存評價 在完成3個周期FOLFOX或FOLFIRI方案化療后，進行胸部、腹部和盆腔CT或MRI檢查。按實體瘤療效評價標準(RECIST)評價近期療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD);其中，CR和PR病例數之和為治療有效病例，有效率(RR)為治療有效病例數占全部病例數的百分比。計算無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)，PFS是指從一線化療開始至PD或死亡的時間，OS是指從一線化療開始至死亡或末次隨訪的時間。隨訪方式為門診或電話隨訪，末次隨訪時間為2012年7月1日。

1.7 統計學方法 腫瘤組織中TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達與臨床病理資料的相關性均采用χ2檢驗分析。所有統計分析由SPSS17.0軟件完成。

2 結果

2.1 TS、TOPO-I、ERCC1在111例結直腸癌組織標本中的表達 TS、ERCC1表達主要集中在細胞質和細胞核中，TOPO-I表達主要集中在細胞核中。見圖1。

2.2 TS、TOPO-I、ERCC1表達與結直腸癌臨床病理特征之間的相關性 TS、TOPO-I、ERCC1的蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、T分期、淋巴結轉移情況及分化程度等臨床病理特征均無明顯差異性(P＞0.05)。見表1。

2.3 療效及生存評價 根據NCCN指南中提出的結直腸癌化療的適應證和建議的化療方案及聯合ERCC1的檢測結果，對50例患者采用了FOLFOX方案化療。考慮患者檢測的時間不一致，只對其中40例患者進行10～14個月的療效及預后隨訪，即中位隨訪時間為1年。結果提示:CR 5例(12.5%)，PR 16例(40.0%)，PD 14例(35.0%)，SD 5例(12.5%)，有效率為52.5%。PFS最少為3個月，最長者未知;在這一年的隨訪中無死亡病例，OS需要繼續隨訪觀察。TOPO-I在111例結直腸癌腫瘤組織中，近50例患者TOPO-I為高表達，根據檢測結果對39例患者行FOLIFRI方案化療，后對其中30例患者進行療效及預后隨訪。結果提示:CR2例(6.7%)，PR10例(33.3%)，PD6例(20.0%)，SD2例(6.7%)，有效率為 40%。PFS最少為5個月，最長者未知;在這一年的隨訪中無死亡病例，OS需要繼續隨訪觀察;在化療過程中及化療后患者的不良反應較輕。

圖1 TS、TOPO-Ⅰ、ERCC1在結直腸癌組織中的表達(DAB，×400)

表1 TS、TOPO-I、ERCC1陽性與結直腸癌臨床病理特征的關系

3 討論

近年來腫瘤的治療取得了相當大的進展，但在不同種族人群或個體間仍存在顯著的治療敏感性和不良反應之間的差異。這主要與腫瘤本身的生物學特性有關。目前常用抗腫瘤化療藥物的有效性不僅低于70%，而且由于缺乏化療藥物個體化治療的遺傳學分析，使20%～40%的患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療，同樣病理類型、病理分期甚至分子表型相同的患者，在接受相同方案治療后可能產生“天壤之別”的結果〔5〕。

腫瘤的個體化治療正是為了改變這種傳統的治療模式，提高腫瘤的治療效果而產生的。所謂腫瘤的個體化治療〔6〕，即醫生根據患者具體情況通過相關檢測與分析，判斷患者對哪種治療敏感，選擇合理的治療方案，以縮短治療時間，減輕毒副反應，延長生命，提高生活質量，達到滿意的治療效果。近年來，遺傳學、基因組學、分子生物學和抗腫瘤藥物作用機制等方面的研究均取得了突破性的進展，結直腸癌的個體化治療也開始從理想走向現實。通過檢測相關基因以預測抗腫瘤藥物的療效，從而為不同患者選擇最合適的治療方案，已成為提高結直腸癌治療療效以及減少不良反應和經濟負擔的必經之路。在我們的研究中，對TS、TOPO-I、ERCC1的表達情況進行檢測，根據檢測結果，結合美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南中國版中建議的化療方案及醫師臨床經驗，選擇合理的化療方案，爭取達到滿意的療效。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為抗代謝類抗腫瘤藥物，是胃腸道腫瘤的基礎用藥之一。5-Fu本身并無生物學活性，在體內，須經合成代謝轉化為核苷酸類似物，發揮細胞毒性作用〔7〕:主要是在胸苷磷酸化酶(TP)催化下，轉化為一磷酸脫氧核糖氟尿嘧啶核苷(FdUMP)，后者與TS、亞甲基四氫葉酸形成三聯復合物，抑制TS活性，阻礙脫氧胸苷酸(dTMP)從頭合成，繼而干擾DNA復制。TS酶〔8〕是處于增殖期的細胞內必需蛋白質，它的功能是催化尿嘧啶脫氧核苷甲基化為胸腺嘧啶脫氧核苷，是DNA生物合成反應中的關鍵酶〔9〕，所以抑制TS就能達到抑制DNA生物合成的目的，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖。TS酶作為5-Fu類藥物的靶向酶，多項研究已證實〔2〕，其在腫瘤中的蛋白表達及其基因多態性與5-Fu的療效相關，腫瘤組織中TS低表達，5-Fu類藥物療效較好，患者總生存期延長;TS高表達，預示5-Fu類藥物耐藥〔10〕。有關研究表明〔11〕，TS 蛋白低表達與TS等位基因的低表達均提示對氟尿嘧啶類藥物敏感，兩者無明顯的差異性。在本研究中，因患者經濟的緣故，我們只檢測了TS蛋白的表達，未行TS基因多態性的進一步檢測。

2011 NCCN指南(中國版)結直腸癌化療方案中提出:FOLFOX或FOLIFRI±西妥昔單抗或帕尼單抗(僅KRAS野生型)，FOLFOX或FOLIFRI±貝伐珠單抗，可用于一線或二線化療。本研究的結果提示，TS在腫瘤組織中70.3%的患者為低表達，即近77例患者對氟尿嘧啶類藥物敏感。綜合我們的療效觀察結果，初步可認為較傳統的經驗化療療效好，進一步的證實有待我們繼續統計分析。

對于氟尿嘧啶的衍生物如替吉奧〔12〕，其主要成分替加氟經過肝臟代謝成5-Fu，進一步發揮抗腫瘤作用，在晚期不能耐受靜脈用藥的結直腸癌或老年性結直腸癌患者中，也取得較好的療效。TS低表達的患者，應用替吉奧或許會取得較好的治療效果，有待我們進一步的研究。喜樹堿衍生物類化療藥物如伊立替康，是TOPO-I的抑制劑〔13〕，其活性代謝產物SN-38與TOPO-I復合物結合，阻止DNA斷裂單鏈的再鏈接。TOPO-I〔14〕是細胞復制、轉錄、反應、修復過程中的重要酶，通過在DNA的核糖-磷酸主鏈上產生一過性的斷裂而改變DNA的拓撲結構，解開DNA纏繞，并在另一DNA鏈從缺口處穿過時，再通過逆向的轉酯反應恢復DNA的完整性。在腫瘤細胞中，TOPO-I含量及活性遠高于正常體細胞〔15〕，抑制拓撲異構酶的活性就可能抑制腫瘤細胞的快速增殖，進而殺死腫瘤細胞。相關文獻指出〔3，16〕，TOPO-I有可能作為預測伊立替康療效的分子標記物，TOPO-I低表達的患者對伊立替康耐藥，高表達者敏感。綜合我們的療效觀察結果，初步可認為較傳統的經驗化療療效好，更準確的分析結果有待我們進一步隨訪觀察。

鉑類藥物對腫瘤細胞的殺傷作用主要通過與細胞內親核的DNA結合，形成鉑-DNA加合物。導致DNA的鏈間交聯或鏈內交聯，引起DNA損傷，從而導致細胞死亡。而機體的損傷修復系統可以修復這類損傷，從而影響鉑類藥物的化療敏感性〔17〕。核苷酸切除修復(NER)是人體DNA損傷修復系統的重要組成部分，鉑類藥物引起的DNA損傷修復主要由這個系統完成〔18〕。ERCC1在NER途徑發揮重要作用，影響腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性〔19〕。多項研究表明〔4〕，在腫瘤組織 ERCC1呈低表達的患者對鉑類藥物敏感，高表達者耐藥。

NCCN指南中推薦的FOLFOX、FOLIFRI及CapeOx方案中，均包含三代鉑類藥物，若奧沙利鉑耐藥，該三種化療方案可能不會取得預期的臨床療效。在111例結直腸癌組織標本中，近77例患者(70%)ERCC1為低表達，提示對鉑類藥物敏感。如前所述，臨床醫生已經對50例患者采用了FOLFOX方案化療，并對40例患者進行治療后的療效隨訪，療效較好。

本研究中，根據衛生部結直腸癌診療規范(2010年版)中提出的結直腸癌化療的適應證，111例結直腸癌患者中有89例可行輔助化療，其中結腸癌患者有42例，直腸癌患者有47例。我院腫瘤科醫生根據本研究的檢測結果，結合NCCN指南中推薦的化療方案，已經對70例患者采用不同的化療方案，并進行化療后的隨訪及觀察，初步認為療效較好，毒副反應較輕。

本研究結果表明，TS、TOPO-I、ERCC1三者在腫瘤患者中的表達情況與臨床病理特征無明顯相關性，是由腫瘤細胞自身的生物學特性決定的。對于TS、ERCC1低表達，TOPO-I高表達的患者采用相關敏感的化療藥物治療后，并進行了一年左右的療效隨訪，發現一部分患者化療后的效果較傳統經驗的好，且毒副反應減輕。本研究將繼續進行臨床療效的跟蹤，其中有一部分患者的化療療效仍不理想。一方面，腫瘤的生長是受多基因調控的，檢測某個基因或某幾個基因并不能反映腫瘤的真實全貌;另一方面，臨床給藥劑量、途徑及方法都可影響化療藥物的療效。TS、TOPO-I、ERCC1三者聯合檢測對結直腸癌化療方案的制訂及藥物的選擇意義重大，為開展個體化治療提供依據。要真正實現腫瘤個體化治療，我們還有很長的路要走。

1 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer Statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2008;58(2):71-96.

2 Fvnegri N，Campanini R，Camis A，et al.Biological predictive factors in rectal cancer treated with preoperative radiotherapy or radiochemotherapy〔J〕.Br J Cancer，2008;98(1):143-47.

3 Rasheed ZA，Rubin EH.Mechanisms of resistance to topoisomerase I-targeting drugs〔J〕.Oncogene，2003;22(47):7296-304.

4 Rosell R，Cobo M，Isla D，et al.ERCC1 mRNA2 based randomized phaseⅢtrial of docetaxel(doc)doublets with cisplatin(cis)or gemcitabine(gem)in stage Ⅳ non-small-cell lung cancer patients〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(16):621.

5 Janelsins MC，Kohli S，Mohile SG，et al.An update on cancer-and-chemotherpy-related cognitive dysfunction:current status〔J〕.Semin Oncol，2011;38(3):431-8.

6 鄭傳宜，覃 西，白恩琪.檢驗醫學與腫瘤個體化治療〔J〕.實用檢驗醫師雜志，2011;(2):110-2.

7 Jin C，Yao L，Long J，et al.Effect of multiple-phase regional intraarterial infusion chemotherapy on patients with resectable pancreatic head adenocarcinoma〔J〕.Chin Med J，2009;122(3):284-90.

8 Ciaparrone M，Quirino M，Schinzari G，et al.Predictive role of thymidylate synthase，dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidine phosphorylase expression in colorectal cancer patients receiving adjuvant 5-fluorouracil〔J〕.Oncology，2006;70(5):366-77.

9 錢小軍，胡 冰.TS酶與5-Fu的關系及在消化道腫瘤個體化治療中的應用〔J〕.安徽醫藥，2010;14(3):252-4.

10 Shahrokni A，Rajebi MR，Saif MW.Toxicity and efficacy of 5-fluorouracil and capecitabine in a patient with TYMS gene polymorphism:A challenge or a dilemma〔J〕.Clin Colorectal Cancer，2009;8(4):231-4.

11 Mauritz R，Giovannett E，Beumer IJ，et al.Polymorphisms in the enhancer region of the thymidylate synthase gene are associated with thymidylate synthase levels in normal tissues but not in malignant tissues of patients with colorectal cancer〔J〕.Clin Colorectal Cancer，2009;8(3):146-54.

12 田 姍，李 曾，王東風.替吉奧單藥治療晚期結直腸癌療效觀察〔J〕.中國老年保健醫學，2011;9(5):37-38.

13 Annamaria B，Manuela P，Angela R，et al.DNA damage persistence as determinant of tumor sensitivity to the combination of topo I Inhibitors and telomere-targeting agents〔J〕.Clin Cancer Res，2011;17(8):2227-36.

14 莫曉媚，李 靜，耿美玉.DNA拓撲異構酶與抗腫瘤〔J〕.中國藥理學通報，2007;23(1):20-3.

15 Ataka M，Ikeguchi M，Yamamoto M，et al.Topoisomerase I protein expression and prognosis of patients with colorectal cancer〔J〕.Yonago Acta Medica，2007;50(4):81-7.

16 Paradiso A，Xu J，Mangia A，et al.Topoisomerase-I，thymidylate synthase primary tumour expression and clinical efficacy of 5-FU/CPT-11 chemotherapy in advanced colorectal cancer patients〔J〕.Int J Cancer，2004;111(2):252-8.

17 Rosell R，Lord RV，Taron M，et al.DNA repair and cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2002;38(3):217-27.

18 Su D，Ma S，Liu P，et al.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2007;56(2):281-8.

19 Olaussen KA，Mountzions G，Sofia JC.ERCC1 as a risk stratifier in platinum based chemotherapy for non-small cell lung cancer〔J〕.Curr Opin Pulm Med，2007;13(4):284-9.