小鼠缺血再灌注損傷后海馬齒狀回Wnt1、Wnt3a的表達變化

羅時鵬 余資江 肖朝倫 余 彥 康朝勝 孫寶飛 李玉美

(貴陽醫學院基礎醫學院人體解剖學教研室，貴州 貴陽 550004)

隨著對腦缺血研究的進展，人們早已打破了成年人腦神經元不能再生的理論〔1〕。新近研究發現腦缺血后原處于靜止狀態的內源性神經干細胞(NSCs)被激活，并增殖分化為新生細胞。在中樞神經系統中，Wnt/β-catenin信號通路是細胞增殖分化的關鍵調控環節，與腦損傷后的修復有關。本研究檢測經典Wnt信號通路中兩個關鍵信號分子Wnt1、Wnt3a在小鼠缺血再灌注后海馬組織中的表達和變化規律，探討Wnt/β-catenin信號轉導通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康1月齡雄性昆明小鼠80只，體重18～25 g，由貴陽醫學院動物實驗中心提供〔合格證號:SCXK(黔)2002-0001〕。隨機分為正常組、假手術組和缺血再灌注后1、3、7、14、21、28 d 組，每組各 10 只。鼠抗 5-溴脫氧尿嘧啶核甘(BrdU)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，小鼠Wnt1、Wnt3a原位雜交檢測試劑盒均購自天津灝洋生物制品有限公司，DAB顯色試劑盒購自福建邁新公司。

1.2 腦缺血再灌注模型制備及BrdU標記 建立小鼠缺血再灌注腦損傷模型，術前12 h禁食，4 h禁水。5%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，仰臥固定于手術操作臺，頸前部皮毛常規消毒，行頸部正中切口，長約2 cm，逐層分離暴露雙側頸總動脈及伴行的迷走神經，無創微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，造成全腦缺血〔2〕。30 min后松開動脈夾恢復再灌注，縫合切口，術中保持動物肛溫(36.6±0.5)℃;假手術組不予夾閉頸總動脈，其余操作同實驗組。各組小鼠均于取腦時間點前24 h，隨機抽取10只小鼠行腹腔注射BrdU，50 mg/kg×3次，每次間隔4 h，并于末次注射12 h后處死。

1.3 取材與切片 模型建立后，于各相應時間點以4%多聚甲醛經心臟灌注固定后取腦。取出腦組織用4%多聚甲醛溶液固定過夜。石蠟包埋組織塊，冠狀連續切片，片厚5 μm，連續貼片，行BrdU免疫組化顯色和原位雜交。

1.4 BrdU免疫組織化學染色步驟 石蠟切片常規脫蠟至水，用3%H2O2滅活內源性酶10 min，行抗原修復后，分別滴加一抗 (山羊抗小鼠β-catinen、cyclineD1多克隆抗體)，陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜，滴加通用型二抗，進行DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質或胞核中出現棕黑色或棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.5 Wnt1、Wnt3a多點標記的地高辛探針原位雜交步驟 ①石蠟切片脫蠟至水;②0.01 mol/L PBS沖洗3次;③滴加過氧化氫封閉液，室溫，20 min，封閉內源性過氧化氫酶;④0.01 mol/L PBS沖洗3次;⑤滴加復合消化工作液，室溫，30 min;⑥0.01mol/L PBS沖洗3次;⑦0.2×SSC沖洗1次，室溫，3 min;⑧滴加預雜交工作液，37℃濕盒孵育1 h;⑨0.2×SSC沖洗，5 min×3次，室溫;⑩滴加雜交工作液，37℃濕盒孵育4 h;○11 2× SSC 沖洗，5 min× 3 次，37℃;○120.2 × SSC 沖洗，5 min×3 次，37℃;○130.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次，37℃;○14滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，37℃濕盒孵育45 min;○150.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次;○16滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復合物工作液，37℃濕盒孵育45 min;○17 0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min ×3 次;○18DAB 顯色;○19梯度乙醇脫水，每步5 min;○20二甲苯透明;○21中性樹膠封片。

1.6 圖像分析 采用CMIAS真彩色醫學圖像免疫組化自動分析系統計數陽性細胞。每只小鼠隨機取5張切片，在200倍光鏡下，每張切片取6個視野，計數每個視野海馬齒狀回顆粒細胞下層的陽性細胞數，以平均值代表各組陽性數結果。

1.7 統計學處理 采用SPSS13.0軟件，計量資料以±s表示，進行F檢驗。

2 結果

2.1 BrdU免疫組化染色 正常組(4.28±0.57)和假手術組小鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層可見少量BrdU陽性細胞，缺血再灌注后3 d BrdU陽性細胞開始增加，缺血再灌注后7 d達高峰(P＜0.05)，隨著灌注時間的延長BrdU陽性細胞數呈下降趨勢，缺血再灌注后14 d開始減少，依舊高于正常水平(P＜0.05)。缺血再灌注后28 d BrdU陽性細胞數降至正常水平(P ＞0.05)。見圖1，表1。

2.2 Wnt1、Wnt3a原位雜交結果 正常組和假手術組海馬齒狀回顆粒細胞下層均無明顯Wnt1、Wnt3a陽性表達。缺血再灌注各組均可見Wnt1、Wnt3a陽性細胞，再灌注后1 d表達開始增加，14 d達高峰，28 d減少至正常水平。與正常組和假手術組比較，均明顯增多(P＜0.05)。見圖2、圖3，表2、表3。

圖1 各實驗組海馬齒狀回區BrdU陽性細胞(SP，×200)

表1 各組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞計數(n=10，±s)

表1 各組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞計數(n=10，±s)

與正常組比較:1)P＜0.05

2±0.52 5.61±1.06缺血再灌注組 15.51±1.021) 20.13±3.471) 55.42±1.971) 14.52±1.911) 12.20±1.191) 4.94±0.641)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d假手術組 2.96±0.46 3.29±0.52 4.62±1.13 4.94±1.44 4.6組別

表2 各組小鼠海馬齒狀回Wnt1陽性細胞計數(n=10，±s)

表2 各組小鼠海馬齒狀回Wnt1陽性細胞計數(n=10，±s)

與正常組、假手術組比較:1)P＜0.05;與缺血再灌注后14 d組比較:2)P＜0.05，下表同

0.38±0.18 - - - - -假手術組 0.37±0.17 - - - - -缺血再灌注組 4.00±0.461)2) 6.88±0.441)2) 15.00±1.461)2) 20.13±1.081) 18.75±0.801) 1.38±0.381)2)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組指標

表3 各組小鼠海馬齒狀回Wnt3a陽性細胞計數(n=10，±s)

表3 各組小鼠海馬齒狀回Wnt3a陽性細胞計數(n=10，±s)

指標0.36±0.16 - - - - -假手術組 0.35±0.15 - - - - -缺血再灌注組 3.95±0.451)2) 6.80±0.431)2) 14.84±1.441)2) 19.92±1.061) 18.55±0.791) 1.36±0.371)2)1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組

圖2 各組海馬齒狀回區Wnt1陽性細胞(SP，×200)

圖3 各組海馬齒狀回區Wnt3a陽性細胞(SP，×200)

3 討論

研究發現缺血性腦損傷造成神經元退行性變的同時，也促進了神經再生〔3〕。進一步的研究顯示成年中樞神經系統中存在具有自我更新和多向分化潛能的NSCs〔4〕。NSCs是神經系統中未發育成熟的神經前體細胞。主要位于側腦室室管膜下區(SVZ)和海馬齒狀回顆粒細胞下層區(SGZ)〔5〕。它具有自我更新和多分化潛能，能通過不對稱分裂產生各種神經細胞的功能。正常情況下神經干細胞處于靜止狀態，但在損傷、缺血等刺激因素的作用下可被激活，發生增殖、遷移、分化等一系列變化來替代壞死的神經細胞，修復損傷、恢復神經功能〔6〕。

BrdU作為胸腺嘧啶核苷的衍生物，可代替胸腺嘧啶在細胞有絲分裂的S期作為原料摻入到細胞合成的DNA中，只要細胞不消亡，BrdU就在細胞核的DNA中長期存留。摻入到細胞DNA中的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體在組織切片上顯示。實驗中常采用活體注射或細胞培養加入BrdU后，利用抗BrdU單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。本實驗可見在正常情況下，NSCs處于靜止狀態，在受到腦缺血再灌注損傷的刺激后，內源性NSCs開始增殖，灌注后7 d NSCs增殖達高峰，隨后細胞增殖逐漸降低。國外研究顯示，腦缺血后NSCs具有增殖能力，參與腦缺血的病理生理過程〔7〕，與本研究結果一致。這說明小鼠腦缺血再灌注損傷可激發內源性NSCs的增殖。

近年來研究表明，缺血性腦損傷造成神經元退行性變的同時，也促進了神經再生，Wnt信號途徑與NSCs的增殖及神經發生密切相關，認為Wnt信號途徑與腦損傷后的修復有關〔8〕。Wnt/β-catenin信號傳導通路由配體(Wnt家族分子)、跨膜受體(Frizzled家族分子和CRP-5/6)、胞漿調節蛋白(DSH、APC、AXIN、GSK-3β、β-catenin)以及核內轉錄因子(TCF/LEF)等組成〔9〕。其中Wnt蛋白為脂質修飾的分泌型蛋白富含半朧氨酸，目前哺乳動物基因組中已經發現19種Wnt基因，可劃分為兩大亞族:Wnt-1和 Wnt-5a亞族。Wnt-1亞族包括 Wntl，2，3，3a，7a，8 等;Wnt-5a亞族包括 Wnt4，5a，6，11 等。其中 Wnt-l亞族激活經典的Wnt/β-catenin信號通路〔10〕，對NSCs增殖及分化有一定的調控作用，對胚胎神經系統發育具有重要作用。Wnt家族是Wnt信號傳導通路中的啟動因子，當受到Wnt蛋白信號刺激時，Wnt蛋白就與跨膜受體Frizzelds以及共同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP-5、LRP-6)結合，作為Wnt信號通路活化的重要起始信號。

Wnt-1蛋白是控制細胞生長、增殖的關鍵分泌信號分子，可傳遞細胞間相互調控信息〔11〕。Wnt-1的缺失可引發中腦和小腦的嚴重缺陷，Wnt-3a的缺失可引起海馬整體功能的喪失〔12〕。Wnt3a是WNT基因家族中的重要成員，在胚胎發育期Wnt3a信號蛋白在Wnt基因家族成員中最先表達〔13〕。Wnt3a是Wnt信號通路中重要的激活劑，大量研究已表明它表達的增加可促進細胞的分裂、加速分化增殖〔14〕。早期國外學者使用純化獲得的Wnt3a蛋白使體外培養的骨髓間充質干細胞大量增殖〔15〕。近期我國學者研究發現Wnt3a蛋白在胚胎發育時期不僅激活了Wnt信號通路，還促進 NSCs的增殖〔16〕。Davidson 等〔17〕通過添加Wnt3a觀察發現，Wnt3a不僅能提高NSCs的數量，還能有效促進克隆球體積的增大。由此可見Wnt3a在中樞神經系統發育、維持NSCs自我更新和分化的過程具有重要作用。

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