電針對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區蛋白激酶C和β-淀粉樣蛋白表達的影響

張海燕 劉忠錦 陳志偉 (齊齊哈爾醫學院組織學與胚胎學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 6006)

阿爾茨海默病(AD)占癡呆總數的50% ～60%〔1〕。其特征是海馬、額葉、顳葉等腦區出現老年斑(SP)和纏結一起神經元及大量突觸連接的消失。臨床表現為學習記憶障礙，智力衰減，常伴有人格劣化。AD的治療現代主要是延緩AD的發展和增強神經元的功能恢復能力，來進一步改善癥狀。本實驗對大鼠海馬的蛋白激酶C(PKC)、β-淀粉樣蛋白(Aβ)測定，旨在證明電針能改善AD大鼠的記憶能力，并進一步探求治療AD的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠60只，體重180～200 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(批號:2010002)。在實驗室穩定條件下飼養1 w。鏈脲佐菌素(STZ，Introvengen公司 批號:I5025)、氫溴酸加蘭他敏(陜西森弗生物技術有限公司批號:100050-197801)、Aβ、PKC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司批號:200810)、腦立體定位儀(NARISHIGE SN-2型)、Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)、G6805-II型電針治療儀(上海醫療器械廠)、華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司)。

1.2 動物造模 大鼠經10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀。常規消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜。微量注射器每側側腦室各注射STZ10 μl，注射前將STZ溶于生理鹽水，濃度為10%。參照《大鼠腦立體定位圖譜》〔2〕:前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm，用微量注射器將STZ在2 min內緩慢注入，留針5 min，充分浸潤局部組織，緩慢拔出微量注射器。第3天重復注射，劑量同前，正常組不予處置，模型對照組操作同前。

1.3 動物分組 所有大鼠經第1天的水迷宮試驗，排除先天愚笨者(不會游泳及原地打轉者);再從剩余60只大鼠中隨機分5組，每組12只。全部實驗動物用相同的飼料喂養，喂養過程中所使用的器皿均為非鋁制品。正常組:給予常規飼養。模型對照組:每側側腦室各注射生理鹽水10 μl。術后常規飼養。模型組:造模后常規飼養。電針組:第2次水迷宮測試結束24 h后，電針組用0.35 mm×25 mm毫針針刺“百會”穴，斜刺約0.5寸，“涌泉”直刺0.3寸。“百會”穴、“涌泉”穴連接電針治療儀，選擇斷續波，頻率為20 Hz，電壓為2 V，強度以肢體輕微抖動為度，用0.35 mm×25 mm毫針針刺大鼠雙側“太溪”穴，直刺進針3 mm，雙側“腎俞”穴，直刺進針5 mm，雙側“足三里”穴，直刺進針4 mm間歇5 min捻轉一次，平補平瀉。每日1次，時間30 min。7 d為一療程，間歇1 d，治療3個療程后進行行為學測試。西藥組:氫溴酸加蘭他敏每日0.5～1 mg/kg體重。

1.4 取材 治療結束后第2天，每組隨機選取10只大鼠大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，快速灌注0.85%生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為4%多聚甲醛，灌注時間約30 min，見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意，取腦并分離海馬，放入4%的多聚甲醛溶液中固定過夜，之后進行石蠟包埋，組織切片，HE染色，免疫組織化學染色。PKC、Aβ免疫反應陽性產物為棕黃色點狀顆粒，主要分布在胞質。采集免疫組化染色圖像，用Imagepro-Plus6.0分析軟件進行圖像分析，每張切片區4個視野測定海馬組織中陽性產物的積分光密度值(IOD)和陽性細胞數。

2 結果

2.1 治療后各組海馬區PKC蛋白表達比較 正常組、模型對照組PKC蛋白有較高表達，模型組PKC蛋白表達水平顯著降低，治療后西藥組、電針組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，見表1，圖1。

圖1 各組大鼠海馬區PKC蛋白表達(DAB，×400)

2.2 治療后各組海馬區Aβ蛋白表達比較 正常組、模型對照組Aβ蛋白有較低表達，模型組Aβ蛋白表達水平顯著升高，治療后西藥組、電針組較模型組表達減少(P＜0.05)。見表2。

表1 各組海馬PKC蛋白表達(± s，n=10)

表1 各組海馬PKC蛋白表達(± s，n=10)

與模型組比:1)P＜0.05，下表同

組別 積分光密度值 表達陽性細胞數(個/高倍視野)正常組 0.324±0.0621) 31.85±14.631)模型對照組 0.329±0.0651) 30.72±15.191)模型組 0.203±0.071 17.25±3.26西藥組 0.304±0.0591) 27.31±10.241)電針組 0.301±0.0641) 26.47±11.631)

表2 各組海馬Aβ蛋白表達(± s，n=10)

表2 各組海馬Aβ蛋白表達(± s，n=10)

組別 積分光密度值 表達陽性細胞數(個/高倍視野)正常組 0.168±0.0071) 10.87±3.151)模型對照組 0.165±0.0041) 11.09±3.281)模型組 0.239±0.012 25.31±2.46西藥組 0.179±0.0061) 20.52±2.631)電針組 0.181±0.0081) 21.94±2.701)

3 討論

祖國醫學認為，腎藏精，生髓，通于腦，“腦為位髓海”，“腦為元神之府”髓海充實，則神清氣朗，耳聰目明。AD常由年老體衰，腎精不足、髓海失養，加之痰濁瘀血阻滯腦竅，神明被蒙，導致記憶衰退，反應呆鈍等癥。歷代醫家已意識到“腎虛血瘀、濁毒內生、損傷腦髓”是AD發病的重要機制，本實驗針刺治療的原則是“補腎活血、化痰通絡、醒神開竅”。在上述治療原則的指導下選出“百會”、“大椎”、“太溪”、“腎俞”、“足三里”組成針灸治療處方。

AD的病理學特征是大腦皮質和海馬區域神經原纖維纏結(NFT)、SP形成以及神經元缺失，其中SP主要成分為Aβ，而NFT主要成分為異常過度磷酸化的 Tau蛋白形成。Aβ在AD的發病機制中具有核心的作用，是AD形成和發展的關鍵因素。PKC對AD的Aβ和Tau蛋白形成起重要作用。PI信號系統參與調節β-淀粉樣蛋白前體(APP)的正常降解過程，水解所產生的DAG使PKC激活，激活的PKC從而使Aβ生成減少。Cordey等〔3〕研究證明經典的PKC亞型能夠阻止Aβ誘導的神經細胞死亡。另一方面，Forlenza等〔4〕研究指出，PKC抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化Tau蛋白的作用，從而可減少Tau蛋白磷酸化。邢偉等〔5〕通過研究發現慢性鋁暴露影響大鼠海馬PKC mRNA和PKC蛋白表達，使PKC活性降低，導致大鼠海馬CA1區長時程形成，從而影響學習記憶功能。該研究表明，PKC活性可以影響神經細胞的學習記憶功能。PKC與突觸可塑性及長時程增強效應(LTP)的形成密切相關。PKC的激活是LTP產生的重要條件之一。針刺通過影響中樞神經系統膽堿能神經系統的功能，抗氧化以及改善突觸形態可塑性及LTP，來直接或間接提高AD大鼠的學習記憶能力〔6～8〕。

綜上所述，電針治療可降低Aβ在腦內的表達，激活PKC表達，在一定程度上阻止神經元細胞凋亡過程;電針可引起激活PKC抑制Aβ和 Tau蛋白形成，可間接減少NFT、SP形成，從而起到保護腦細胞、延緩衰老的作用。這可能是針刺能有效地防治老年性癡呆的作用機制之一。

1 Blennow K，de LM，Zetterberg H.Alzhemier’s disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京:人民衛生出版社，1994:20-40.

3 Cordey M，Pike C.Conventional protein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen〔J〕.Neurochemisry，2006;96(1):204-17.

4 Forlenza OV，Spink JM，Dayanandan R，et al.Muscarinic agonists reduce tau phosphorylation in non-neuronal cells via GSK-3beta inhibition and in neurons〔J〕.J Neural Transm，2000;107(10):1201-12.

5 邢 偉，王 彪，文 濤，等.鋁暴露對大鼠海馬蛋白激酶Cr亞型影響〔J〕.中國公共衛生，2007;23(3):305-7.

6 劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對老年癡呆大鼠學習記憶功能及海馬膽堿乙酰化酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響〔J〕.針刺研究，2009;34(1):48-51.

7 彭 靜，曾 芳，何宇恒，等.電針對SAMP 8小鼠海馬線粒體作用的研究〔J〕.針刺研究，2007;32(6):364-7.

8 唐 勇，尹海燕，曾 芳，等.針刺原位誘導阿爾茨海默病海馬內源性神經干細胞的思考〔J〕.中西醫結合學報，2005;3(5):351-3.