硫氧還蛋白對缺氧/復氧人臍靜脈內皮細胞的保護作用

蘇 偉 高 楓 孫茂民 江家貴 (南京中醫藥大學無錫附屬醫院，江蘇 無錫 2400)

正常生理狀態下，內皮細胞可分泌多種血管活性物質，調節血管收縮與舒張。當內皮損傷時，氧自由基生成增加，舒血管物質如前列環素(PGI2)和內皮源性舒血管因子〔(EDRF，即一氧化氮(NO)〕等釋放減少，而內皮素(ET)、血栓素A2(XA2)等縮血管物質釋放增多。血管內皮細胞(VECs)損傷是動脈硬化發生的始動環節〔1〕，當VECs受損時，可導致血壓增高、動脈硬化等疾病〔2〕。硫氧還蛋白(TRX)是機體內重要的氧化還原調節蛋白，Mr為12 kD，在體內分布廣泛，具有多種生物學功能〔3〕。研究證實，硫氧還蛋白參與機體的氧化還原反應，影響細胞的增殖和生存，調節多種轉錄因子的活性，參與某些組織的應激反應。近年來，TRX在心血管系統疾病中的作用也日益受到人們關注。我們在試驗中發現人內皮細胞株ECV304沒有硫氧還蛋白的表達。本文對TRX基因修飾的ECV304細胞進行缺氧/復氧實驗，探討TRX其對內皮細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ECV340(購自中科院上海細胞所)，ECV304/TRX細胞株系本室構建，胎牛血清(杭州四季清)，1640培養基(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，噻唑藍(MTT，Sigma公司產品)。丙二醛(MDA)及NO檢測試劑盒(南京建成生物有限公司產品)，ET檢測試劑盒(華美生物有限公司產品)。

1.2 細胞分組及缺氧/復氧模型的建立 將不同內皮細胞分為3組:ECV304/TRX組、pcDNA3.0空載體轉染組(空載體組)及正常對照組(ECV304組)，參照文獻〔4〕對前兩組細胞進行缺氧實驗，同時設置未缺氧的ECV304細胞作為對照組。

2 結果

2.1 TRX對缺氧/復氧的內皮細胞內MDA的影響 ECV304組，其細胞內的MDA含量在24 h內變化不大;空載體組，在缺氧3 h時，MDA含量顯著增加，復氧12 h時，MDA含量達到最高，然后緩慢下降;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復氧12 h時，MDA含量極顯著下降(P＜0.01)，而在24 h MDA水平下降顯著(P＜0.05)。見表1。

2.2 TRX對缺氧/復氧的內皮細胞釋放NO的影響 ECV304組，其細胞內的NO含量在24 h內變化不大;空載體組細胞在缺氧3 h時，NO含量顯著下降，復氧12 h時，NO含量下降到最低，然后緩慢上升;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復氧12 h時，NO含量極顯著上升(P＜0.01)，在12 h時 NO水平最高。ECV304/TRX組與ECV304組相比，在12 h時，有顯著差異。見表2。

2.3 TRX對缺氧/復氧的內皮細胞釋放 ET-1的影響 ECV304組，其細胞內的ET-1含量在24 h內變化不大;空載體組，在缺氧3 h，細胞內ET-1含量迅速上升，復氧12 h時，ET-1含量上升最高;ECV304/TRX組與空載體組相比，ET-1水平在復氧的各時間點均比有下降，在復氧24 h下降最明顯(P＜0.01)。見表3。

表1 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞MDA的影響(±s，μmol/L)

表1 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞MDA的影響(±s，μmol/L)

與轉染空載體組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別0.54±0.02 0.72±0.03 1.03±0.07 1.24±0.10空載體組 0.56±0.04 5.64±0.17 8.38±0.08 3.15±0.07 ECV304/TRX組 0.49±0.05 1.96±0.041)2)3.42±0.031)2.62±0.032)0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組

表2 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞NO的影響(±s，μmol/L)

表2 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞NO的影響(±s，μmol/L)

與空載體組比較:1)P＜0.01;與ECV304組比較:2)P＜0.05

實驗組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 54.42±7.55 56.32±7.87 58.13±7.54 62.46±7.21空載體組 51.25±6.23 30.19±5.24 23.40±5.65 35.26±5.44 ECV304/TRX組52.49±8.65 60.96±10.041)75.43±9.531)2)65.82±8.731)

表3 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

表3 TRX對缺氧/復氧不同時間點內皮細胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

與空載體組及ECV304組比較:1)P＜0.01

實驗組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 10.52±2.12 10.42±2.15 10.63±2.09 10.24±2.10空載體組 10.48±2.11 50.56±10.04 56.64±10.17 52.38±9.08 ECV304/TRX組 10.32±2.13 30.49±5.251)25.96±5.441)22.42±4.831)

3 討論

內皮細胞覆蓋在血管內膜表面，具有多種重要的生理功能，參與機體的凝血、免疫、物質轉運和生物活性物質釋放等過程。在缺氧及缺氧復氧中，內皮細胞是組織中受攻擊的第一靶器官，其中內皮源性的舒血管因子和縮血管因子的分泌調節功能更是最先受損〔5〕。缺氧/復氧后活性氧產生可以透過細胞膜，在膜外與Fe2+或Cu2+生成羥自由基，從而引發脂質過氧化(LPO)而導致損傷，羥自由基在缺氧再復氧損傷中起核心作用〔6〕。一旦內皮細胞受損，其分泌血管活性物質的功能將發生改變，通過測定VECs分泌的血管活性物質，可判斷內皮細胞功能，NO就是VECs損傷的敏感的標志物〔7〕。當ECV中氧自由基過多時，其與NO作用，生成一些硝基化合物，使NO減少。

本實驗說明缺氧損傷內皮，使內皮依賴性的血管舒縮功能紊亂，而復氧后進一步加重缺氧帶來的損傷，且缺氧及缺氧復氧帶來的損傷至少可持續至復氧后12 h，復氧24 h后內皮依賴的血管舒縮活性有所恢復但未能完全恢復。

氧自由基大量產生是目前公認的缺氧及缺氧復氧造成細胞損傷的主要機制之一〔8〕。本研究發現，除氧自由基外，缺氧及缺氧復氧還可通過其他機制抑制內皮細胞NO、ET的生成。缺氧及缺氧復氧可直接作用于(NO)合成的限速酶一氧化氮合酶(NOS)，使其活性下降〔9〕;還引起生成NO的底物 L-精氨酸大量耗竭，使L-精氨酸跨膜轉運障礙，使NO生成減少〔10〕。同樣，缺氧及缺氧復氧可直接作用于ET基因，使ET轉錄增加;缺氧及缺氧復氧還刺激凝血系統，使凝血酶生成增加，通過凝血酶刺激 ET 大量生成〔11，12〕。

TRX能升高缺氧-復氧環境下ECV中NO的釋放，可能是通過降低缺氧/復氧ECV產生氧自由基的量，減少氧自由基對NO的滅活;同時，TRX也可能通過活化NOS，使NO含量顯著升高而抗ECV損傷。

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