NF-κB p65在去卵巢大鼠骨丟失中的作用

郭 影 郭 麗 張陳彥 狄建敏 (河北醫科大學第三醫院，河北 石家莊 05005)

骨保護蛋白(OPG)/RANKL/核因子 κB受體活化因子(RANK)系統是近年來發現的在破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路，作為雌激素發揮抗骨吸收作用的中間環節，提出成骨細胞調控破骨細胞分化成熟的機制，在絕經后骨質疏松(PMOP)發病中發揮重要作用，其中核轉錄因子(NF)-κB通路調節破骨細胞發育和蛋白酶合成。NF-κB是誘導破骨細胞產生中最重要的轉錄因子之一，抑制該因子或抑制其介導的信號通路中其他細胞因子的表達可減少甚至抑制破骨細胞的生成。本研究以去卵巢大鼠建立PMOP模型，觀察各組大鼠體重、股骨骨密度(BMD)及骨組織學變化，檢測各組大鼠骨組織中NF-κB p65，研究NF-κB表達異常與PMOP發生的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組和PMOP動物模型制備 3月齡成年雌性Sprague/Dawley大鼠30只，隨機分為兩組，每組15只:①假手術(Sham)組、②卵巢切除(OVX)組。將大鼠以10%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下，經腰背部正中縱形切口進入腹腔背側，將OVX組大鼠切除雙側卵巢，Sham組大鼠切除雙側卵巢下方少許脂肪組織，重量約與卵巢相同。術后正常攝食水，實驗共12 w。

1.2 雙能X線吸收法確立PMOP動物模型 于去勢后12 w，分別取各組大鼠置于Osteocore3型雙能X線骨密儀上，通過計算機系統中心動物軟件，測量每只大鼠雙側股骨及腰椎BMD，取平均值。BMD值用g/cm2表示。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學染色 動物處死后，立即無菌操作取左側股骨下段，進行HE染色、免疫組織化學染色及觀察。

1.4 結果判定與圖像分析、統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，所測數值均以±s表示，方差齊性檢驗采用Levene法，各組間變量比較采用完全隨機的單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠股骨BMD比較 與Sham組〔(0.209±0.010 5)g/cm2〕相比，OVX組 BMD明顯下降〔(0.181±0.008 5)g/cm2〕(P＜0.05)。

2.2 骨組織學觀察 與Sham組大鼠比較，OVX組大鼠骨皮質變薄，骨小梁稀疏或斷裂，骨髓腔增寬。見圖1。

圖1 兩組骨組織學觀察(HE)

2.3 免疫組織化學染色觀察及結果 NF-κB p65主要位于骨小梁周邊成骨細胞、骨細胞中，骨髓基質細胞亦呈陽性染色。OVX組骨小梁周邊NF-κB p65陽性細胞數明顯多于Sham組，且表達強于Sham組。見圖2。

與Sham組(105.59±4.938)相比，OVX組大鼠骨組織中NF-κB p65陽性細胞染色灰度值(150.506±5.510)增高(P＜0.05)。

圖2 免疫組織化學染色觀察兩組骨組織NF-κB p65 陽性細胞(DAB)

2.4 相關性分析 與Sham組相比，OVX組NF-κB p65表達與BMD呈負相關(r=-0.765，P＜0.05)。

3 討論

切除雙側卵巢是復制PMOP模型的經典方法，3～9月齡為復制該模型大鼠的合適鼠齡〔1〕。本研究中選取3月齡成年雌性S/D大鼠為研究對象，BMD測定及組織學觀察顯示，OVX組大鼠較Sham組相比，BMD明顯下降，骨皮質變薄，骨髓腔擴大，骨小梁稀疏或斷裂，骨小梁寬度變窄、間距變寬，表明PMOP模型建立。

骨組織中NF-κB家族是控制破骨細胞生成和激活的重要因子，主要位于成骨細胞，骨細胞及骨髓基質細胞中。動物研究表明NF-κB p50/p52基因敲除的小鼠，表現為骨骼石化癥〔2〕。其原因可能是在RANKL及其他破骨細胞刺激因子作用下，RANK刺激破骨細胞前體細胞分化為抗酒石酸性磷酸酯酶陽性(TRAP+)破骨細胞的途徑中，NF-κB介導的細胞內信號轉導通路受阻造成〔3〕。

研究表明雌激素可能通過以下幾種途徑抑制NF-κB的表達:(1)雌激素可通過阻斷IκB激酶(IKK)的活化，減少IκB的降解，從而抑制 NF-κB 的活化〔4〕;(2)雌激素受體與 NF-κB 之間有相互拮抗作用，雌激素可以通過上調受體途徑抑制NF-κB的活化〔5〕;(3)雌激素通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子，進而抑制細胞因子誘導的NF-κB活化〔6〕。PMOP中由于雌激素的減少，使之對NF-κB的抑制作用減低，NF-κB在骨組織中表達異常增加，導致受其調節的靶基因表達異常增多，如破骨細胞刺激因子白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)及TNF-α等，最終造成絕經后的骨丟失。

本試驗與上述研究結果一致，結果顯示:(1)免疫組織化學觀察，NF-κB p65陽性信號主要位于骨小梁周邊成骨細胞、骨細胞及骨髓基質細胞中，OVX組骨小梁周邊陽性細胞數明顯多于Sham組。(2)骨組織中NF-κB p65陽性細胞染色灰度值測定結果，OVX組骨組織中NF-κB p65明顯高于Sham組。(3)NF-κB p65與BMD相關性分析結果顯示，與Sham組相比，OVX組NF-κB p65表達與BMD呈負相關。可見，伴隨NF-κB p65在兩組大鼠骨組織中表達增高，BMD有下降的趨勢，而且在OVX組中NF-κB p65表達與BMD呈負相關，表明NF-κB在PMOP的發病機制中可能起到重要作用。

1 Shiraishi A，Takeda S，Masaki T，et al.Alfacalcidol inhibits bone resorption and stimulates formation in an ovariectomized rat model of osteoporosis:distinct actions from estrogen〔J〕.J Bone Miner Res，2000;15(4):770-9.

2 Iotsova V，Caamano J，Loy J，et al.Osteopetrosis in mice lacking NF-κB1 and NF-κB2〔J〕.Nat Med，1997;3(11):1285-9.

3 Soysa NS，Alles N.NF-kappa B functions in osteoclasts〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2009;378(1):1-5.

4 Sun WH，Keller ET，Stebler BS，et al.Estrogen inhibits phorbol ester-induced I kappa B alpha transcription and protein degradation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;244(3):691-5.

5 Mckay LI，Cidlowski JA.Cross-talk between nuclear factor-kappa B and the steroid hormone receptors:mechanisms of mutual antagonism〔J〕.Mol Endocrinol，1998;12(1):45-6.

6 Yamaguchi M，Weitzmann MN.The estrogen 17 beta-estradiol and phytoestrogen genistein mediate differential effects on osteoblastic NF-kappaB activity〔J〕.Int J Mol Med，2009;23(2):297-30.