HLA－B27基因亞型分型檢測

黃寶英，楊 菁，富顯果，曹羅元，唐寶佳

（福建醫科大學附屬寧德市醫院 細胞分子生物學實驗室，福建 寧德352100）

強直性脊柱炎（ankylosing spongdylitis，AS）是一種病因不明的骨－韌帶結合部慢性炎性疾病，主要累及骶骼關節、脊柱、脊柱軟織及四肢關節，多見于中青年男性，主要癥狀是腰、骶以及下肢關節疼痛，晚期患者脊柱僵直成板狀，活動受限，基因遺傳和免疫因素在其發病中發揮重要作用，患者體內存在復雜的免疫功能改變［1，2］。1973年Brewerton等人發現HLA－B27基因與強直性脊椎炎關系密切，該觀點已經通過研究得到證實［3］。研究表明，AS患者中HLA－B27陽性率高達96%以上，而正常人群中僅為4%－7%［4］。因此，HLA－B27成為診斷強直性脊椎炎的有力工具。

HLA－B27的檢測包括微量淋巴細胞毒性試驗（CDC）、流式細胞術（FMC）、PCR分型檢測等方法，CDC法操作復雜，FMC法雖然檢測靈敏，但成本高，儀器昂貴，標本不易存放，而分型檢測結果準確性高，操作簡單，成本相對低，并且不需要活細胞，因此，分子分型檢測 HLA－B27成為一種趨勢［5］。

本實驗采用HLA－B27SSP亞型分型試劑盒進行分型檢測，其中含有1個HLA－B27抗原的決定引物和7個HLA－B27亞型抗原的引物，用以檢測HLA－B27型別。

1 材料與方法

1.1 材料

全自動流式細胞儀（貝克曼、Epics XL）；凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司、GenoSENS1500）；電泳儀（北京市六一儀器有限公司、DYCP－32B）；PCR熱循環儀（美國 Applied Biosystems公司、2720型）；生物安全柜（Heal Force，HFSafe 1200TE CB2型）。PCR試劑（10×Taq Buffer、dNTP、Taq酶）、TA克隆試劑盒、DNA分子量標準DL2000（大連寶生物公司產品），DNA提取試 劑 盒 （SE Blood DNA Kit D3471－01，OMEGA bio－tek），HLA－B27MorganTM SSP亞型分型試劑盒（美國TBG有限公司）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 標本采集

將50μL全血加入測定管中，加入10μl免疫熒光標記的單克隆抗體HLA－B27FITC/HLA－B7 PE，混勻，室溫避光孵育20min；加入250μl Optilyse C溶血素，混勻，室溫避光15min；加入500l鞘液，混勻，3 000r/min離心1min，棄上清液，重復該步驟，最后加入500μl鞘液重懸細胞，上機檢測。

1.3 基因亞型分型

1.3.1 基因組DNA提取 使用OMEGA公司血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.2 目的片段擴增 根據GeneBank中 HLAB27基因的cDNA序列，設計保守序列引物E91F：5’－GGGTCTCACACCCTCCAGAAT－3’、E136R：5’－CGGCGGTCCAGGAGCT－3’，以及一對內參引物 BGF：5’－CTCAGGAGTCAGATGCACCA－3’、BGR：5’－ACTCCTAAGCCAGTGCCAGA－3’。PCR反應體系如下：1μl10×Taq PCR Buffer，0.8 μl dNTP （2.5mmol/L），2μl E91F/E136R （10 μmol/L ），1μl BGF/BGR （10μmol/L ），2μl DNA，0.1μl Taq DNA Polymerase，置一 PCR 管中，混勻，按以下循環條件擴增：94℃5min，94℃1 min，62℃30s，72℃30s，30個循環；最后72℃延伸7min。將10μl擴增產物加入10%瓊脂糖凝膠，置于1×TAE緩沖液中電泳。

1.3.3 HLA－B27試劑盒檢測 用 HLA－B27MorganTM SSP亞型分型試劑盒進行檢測試驗，樣品A260/A280在1.65－1.8之間，樣品的濃度在10－80 ng/μl。PCR反應體系如下：10μl Master Buffer，2 μl DNA，0.06μl Taq DNA Polymerase，置一 PCR管中，混勻，按以下循環條件擴增：96℃2.5min；96℃15s，65℃1min，10個循環；95℃15s，62℃50s，72℃30s，22個循環，將8μl擴增產物加入10%瓊脂糖凝膠，置于1×TAE緩沖液中電泳。

2 結果

2.1 流式細胞儀篩選陽性樣本

通過流式細胞儀對收集的樣本進行檢測，當HLA－B27MFI超過8，HLA－B27＋和 HLA－B7一細胞百分比超過90%時，可以判斷樣本為陽性［5］，結果如下（圖1）。共選取259個流式細胞儀檢測的樣本，其中陽性樣本232例，男性163例，女性69例，陰性樣本27例。

圖1 流式細胞儀檢測結果

2.2 HLA－B27PCR－SSP法檢測

通過PCR擴增HLA－B27目的片段，結果有4個PCR結果與流式細胞儀的檢測結果不同，目的基因片段在135bp處，內參條帶大小為250bp左右（圖2）。

2.3 PCR－SSP檢測基因亞型

圖2 HLA－B27目的片段擴增結果

隨機選取91個PCR陽性樣本，以及4個與流式細胞儀檢測結果不符的樣本，用分型檢測試劑盒進行試驗，結果4個樣本結果為陰性，與PCR結果相符。PCR陽性樣本中2例表現為HLA－B27陽性（圖3A），但無型別，占2.20%；88例表現為B2704/25（圖3B），占96.7%；1例表現為B2705（圖3C），占1.10%。另取2個流式細胞儀檢測與PCR擴增均為陰性的樣本作為對照，檢測結果為陰性（圖3D）。

圖3 HLA－B27分型檢測

3 討論

強直性脊柱炎是一種病因不明的自身免疫性疾病，患者有明顯的家族遺傳性，男性患者明顯多于女性，且臨床表現較女性嚴重［2］，本實驗收集了232例強直性脊柱炎患者樣本，其中163例為男性，69例為女性，直接證明了強直性脊柱炎發生存在明顯的性別差異。

在本研究中發現，用PCR檢測B27基因比流式細胞儀檢測的準確性更高，但是費時也比較長，因此，在臨床上可以用PCR作為輔助手段，進一步判斷弱陽性的樣本，提高準確性。

人類白細胞抗原HLA是已知的人類等位基因多態性最高的遺傳系統，共有44個基因，HLA－B27是其B位點上的第27個等位基因。HLA－B27目前已經發現有99個亞型，命名依次從B2701－B2799，據報道稱在所有亞型中，B2705分布最廣，遍及世界各地的各族人群，且在所有人種中為主要優勢亞型，是目前所發現亞型的原型，其他以此作為模板突變而來，HLA－B2704、06、07只在東方人種中發現，其中B2704是主要亞型，約占55%［6，7］。B2704等位基因陽性百分率從國內地理分布來看，從北向南也具有逐漸遞增趨勢，而B2705的分布趨勢則相反［8］。

本實驗中，隨機選取91例流式細胞儀檢測及PCR檢測均為陽性的樣本，用HLA－B27分型試劑盒分型檢測，結果88例表現為B2704/25（條帶1、5、8陽性），占96.7%，是主要型別；1例表現為B2705（條帶1、2、4、8陽性），占1.10%；2例表現為 HLAB27陽性（條帶8陽性），但無型別，占2.20%。寧德市地處東南沿海，符合B2704、2705的分布規律。另外兩例陽性型別未確定樣本，還需要進一步進行研究。

［1］汪 薇，李志強.HLA－B27基因亞型與強直性脊柱炎的相關性研究［J］.臨床輸血與檢驗，2009，11（4）：376.

［2］閻 歡，王 薇，胡志東.強直性脊柱炎患者 HLA－B27亞型與KIR基因相關性研究［J］.陜西醫學雜志，2012，41（3）：281.

［3］C.E.M.Voorter，W.T.N.Swelsen，E.M.van den Berg－Loonen，et al.B27in molecular diagnostics：Impact of new alleles and polymorphism outside exons 2and 3［J］.Tissue Antigens，2002，60：25－35.

［4］汪 薇，李志強.HLA－B27基因亞型與強直性脊柱炎臨床特征的相關性［J］.臨床輸血與檢驗，2010，12（1）：31.

［5］胡曉舟，苑 騰，王小林.流式細胞術與定量PCR法檢測 HLAB27的比對［J］.中國實驗診斷學，2009，13（6）：745.

［5］汪 薇，李志強.強直性脊柱炎患者HLA－B27基因亞型及序列研究［J］.中國輸血雜志，2011，24（9）：743.

［7］程四國，王藝芳，張伯偉.HLA－B27基因亞型與強直性脊柱炎的相關性調查［J］.中國輸血雜志，2010，23（5）：392.

［8］陸 君，汪 薇，李志強.強直性脊柱炎患者HLA－B27基因亞型及序列研究［J］.中國輸血雜志，2011，24（9）：743－745.