沉默缺氧誘導因子－1α對卵巢癌化療敏感性的影響

孟 迪，劉愛民，馬曉艷，盧 瑋

（吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春130041）

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，死亡率高達70%，嚴重威脅著婦女的健康和生命安全。隨著腫瘤細胞的失控性生長，缺氧已經廣泛存在于惡性腫瘤的微環境之中。腫瘤細胞適應缺氧環境的途徑往往是通過提高糖酵解的速率及形成多血管體系，而缺氧誘導因子－1α（HIF－1α）是促進糖酵解和血管生成的重要因子，因此HIF－1α在惡性腫瘤血管生成、侵襲及轉移的過程中起到重要作用［1］。目前，卵巢癌的化療療效并不十分理想，致使卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊不前，因此，如何提高卵巢癌化療的敏感性成為治療卵巢癌的關鍵，也成為臨床上迫切需要解決的問題。本研究應用RNA干擾（RNAi）技術，選擇 HIF－1α基因作為靶點，抑制人卵巢癌細胞HIF－1α的基因表達，為增加卵巢癌化療的敏感性提供了新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料 SKOV3（人卵巢漿液性囊腺癌細胞株）購自上海研晶生物公司，由吉大二院中心實驗室傳代培養。質粒pSilencer2.1－U6－neo和 MTT 試劑購自Sigma公司，cDNA逆轉錄試劑盒購自科克美（北京）生物醫學科技有限公司，HIF－1α單克隆抗體購自上海博古生物公司，工具酶購自百奇生物，胎牛血清購自Hyclone公司，質粒小提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，順鉑為江蘇豪森藥業產品，DH5α購自克勞寧北京生物公司，凋亡試劑盒購自南京百奧生物科技有限公司，所需寡核苷酸序列由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 HIF－1αsiRNA 載體構建 針對 HIF－1α基因mRNA，選擇一段特異性堿基序列作為干擾靶點，編碼發卡RNA的雙鏈雙鏈寡核普酸序列：Forward 5’－GATGAGAACATGTCACCTTTT CAAGTTCCTTGTCAGTGAGATTGGAAGTCCAGATTGCTCTGACA－3’，Rreverse 3’－GTAGGTCTCAGTGACCTTGAAAGTTTCTCTTCAAGGTCACTGAGACCTAAAAAAACAGCTGTTCGA－5’。模板鏈的兩端引入HindⅢ和BamHⅠ兩個酶切位點。采用無同源性序列的無目標siRNA作陰性對照。

1.2.2 構建重組質粒及瞬時轉染 DNA片段退火后將質粒 pSilencer2.1－U6－neo雙酶切（HindⅢ，BamHⅠ），T4連接酶連接，用連接產物轉化DH5α（感受態大腸埃希菌），涂于LB培養基上，24h后隨機挑取菌落，接種在LB培養液中振蕩12h，采用堿裂解法提取質粒并定量。將SKOV3細胞接種于6孔板內（4X105/孔），用含10%胎牛血清的 RPMI－1640培養基，37℃，5%CO2培養，當貼壁細胞融合達到80%－90%時轉染重組質粒，改用含20%胎牛血清的RPMI－1640培養基繼續培養24小時。采用G418抗性篩選14天，獲得已轉染質粒細胞（穩定存活）。實驗分3組：空白組（SKOV3），非特異對照組（SKOV3NS），目的siRNA組（SKOV3siRNA）三組。

1.2.3 RT－PCR 檢測 HIF－1αmRNA 表達 采用Trizol法提取細胞總RNA并測定其濃度和純度，經RT反應獲取cDNA，根據人HIF－1α基因cDNA序 列，進 行 PCR 引 物 設 計：HIF－1α－upper：5’－CCCATCACACATGTAAGTTAGATC－3’；HIF－1α－lower： 5’－TGGAGAAGTTGCTAATGGAGTAG－3 ’。 β－actin－upper： 5 ’－CATGCCTCTGCTTTCTGTCA－3’；β－actin－lower：5’－TCACCTCTTGTCAGCTGTG－3’。分別在相同條件下以HIF－1α和內對照β－actin的引物進行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性4min，94℃變性45s，53℃退火45s，73℃延伸30s，進行35個循環，最后72℃延伸8min。PCR產物經20g/L瓊脂糖凝膠電泳，染色、照相后進行圖像灰度差異分析。

1.2.4 Western Blot法檢測HIF－1α蛋白表達 消化并收集細胞后提取總蛋白，進行蛋白定量，SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離蛋白，將膠樣電轉至硝酸纖維素膜上，12h后5%脫脂奶封閉，加入HIF－1α單克隆抗體（1∶1000）4℃過夜，0.1%Tween－PBS洗膜3次（10min/次），邊洗邊搖，加入二抗過氧化物酶標記兔抗鼠IgG（1∶5 000），室溫1h后PBST重復洗膜3次，ECL發光壓片顯色，曝光后圖片掃描分析結果。

1.2.5 MTT法檢測細胞抑制率 將三組細胞消化后分別制成單細胞懸液，接種于96孔板中（4×104/孔），每孔體積200μl，培養液中加入順鉑（終濃度為20μmol/L［2］），各組設有自身不加 DDP的復孔作為空白對照。37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養培養72h，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20 μL，37℃溫育4－6h，1 000r/min離心5min后棄去孔內培養液，加入DMSO 150μL/孔，振蕩10min，使甲臜充分溶解，選擇490nm波長，酶標儀測定各孔吸光度值（A值），記錄結果。細胞抑制率＝（1－加藥組平均A值/空白對照組平均A值）×100%。

1.2.6 流式細胞術（FCS）檢測細胞凋亡率 采用胰酶消化法重懸經順鉑作用后的各組細胞，制備各組單細胞懸液并計數，加入5μl Annexin V－FITC和15μl碘化丙啶，避光室溫反應20min。離心機上1 000rpm，離心5min后棄上清，加入200μl結合液輕輕重懸細胞。加入10μl碘化丙靛染色液，輕輕混勻。流式細胞儀檢測凋亡率。

1.3 統計學處理 所有數據以均數±標準差表示，采用SPSS13.0統計軟件分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT－PCR檢測 HIF－1αmRNA表達結果 見圖1，轉染卵巢癌細胞后，進行圖像灰度分析，空白組、非特異對照組和目的siRNA組細胞HIF－1αmRNA檢測結果分別為0.535±0.071、0.472±0.083和0.316±0.085。與兩對照組相比，目的siRNA組細胞HIF－1αmRNA表達水平明顯降低，P值分別為0.005和0.008，提示差異有統計學意義；空白組與非特異對照組兩組細胞比較，HIF－1αmRNA表達水平差異無統計學意義（P＝0.725）。

圖1 細胞HIF－1αmRNA PCR檢測圖

2.2 Western Blot法檢測HIF－1α蛋白結果 見圖2。空白組、非特異對照組和目的siRNA組細胞HIF－1α蛋白檢測結果分別為0.551±0.094、0.573±0.082和0.339±0.092。與兩對照組相比，目的siRNA組細胞HIF－1α蛋白表達明顯降低，P值分別為0.028和0.014，提示差異有統計學意義；而空白組與非特異對照組比較，細胞HIF－1α蛋白表達差異無統計學意義（P＝0.652）。

圖2 細胞HIF－1α蛋白Westem blot檢測結果

2.3 MTT檢測細胞抑制率結果 經順鉑作用后，空白組、非特異對照組和目的siRNA組細胞抑制率分別為0.456±0.127、0.431±0.136和0.721±0.114。與兩組對照組相比，目的siRNA組細胞抑制率明顯增加，P值分別為0.014和0.018，差異均有統計學意義；而空白組與非特異對照組比較，P＝0.865，提示細胞抑制率差異無統計學意義。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率結果 見圖3。經順鉑作用后，空白組、非特異對照組和目的siRNA組細胞凋亡率分別為19±3、19±2和36±3。與兩對照組相比，目的siRNA組細胞凋亡率明顯增加，P值為別分0.001和0.002，提示差異均有統計學意義；而空白組與非特異對照組比較，P＝0.862，提示細胞凋亡率差異無統計學意義。

圖3 細胞凋亡FCS檢測圖

3 討論

缺氧誘導因子－1α（HIF－1α）是一種調節缺氧反應和保持氧穩態平衡的關鍵轉錄因子，在低氧環境下，能夠通過活化下游靶基因，使腫瘤細胞的葡萄糖轉運和糖酵解增加，促進局部新生血管的生成來恢復內環境穩定，從而適應乏氧微環境，因此，HIF－1α在惡性腫瘤血管生成、侵襲及轉移過程中均起到重要的作用。Wong等實驗研究［3］表明，在正常人類組織中并未檢測到HIF－1α蛋白的表達，而在多種人體惡性腫瘤組織中則存在著HIF－1α蛋白的表達顯著增高，且隨著腫瘤分期及惡性程度的增高，HIF－1α蛋白表達也呈明顯增高趨勢［4，5］。因此，HIF－1α可以作為評價早期卵巢癌侵襲能力的重要生物學標記物，降低卵巢癌組織中缺氧誘導因子－1α的表達對抑制卵巢癌的生長及轉移具有重要意義。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術是指將雙鏈RNA（dsRNA）導入目的細胞中，其中的一條單鏈與靶mRNA特異性結合后將其降解，并引起轉錄后基因沉默（PTGS），從而表現出細胞特定基因缺失的表型。RNAi技術與其他轉錄后基因治療方法相比，可通過降解靶基因并以自身作為引物進行合成，通過兩種方式瀑布式地增殖，短時間內能夠高效地抑制靶基因表達，轉染siRNA48h后即可看到明顯的靶基因表達抑制率高于90%。同時，siRNA能夠對靶基因發揮較特異性的抑制作用，其堿基序列與靶基因的mRNA序列能達到完全匹配，siRNA其中任何一個堿基發生改變，均不能與靶基因相結合，從而導致RNA干擾失敗。Brummelkamp等研究［6］表明，siRNA表達載體可以長期并穩定地抑制目的基因在哺乳動物體內的表達，表明siRNA技術沉默基因具有高效性和特異性，siRNA技術能夠為基因治療提供了一個有效的工具。

化療在卵巢癌的臨床治療中占有重要地位，化療的療效直接影響患者的生活質量和生存時間，如何提高卵巢癌的化療敏感性成為臨床上迫切需要解決的問題。順鉑（DDP）是臨床上治療卵巢癌常用的化療藥物之一，具有較強的細胞毒性，可以在抑制腫瘤細胞DNA復制過程的同時損傷其細胞膜結構，有較強的廣譜抗腫瘤作用。DDP具有類似烷化劑雙功能基團的作用，進入細胞后水解為陽離子水化物，并與腫瘤細胞DNA鏈上的堿基發生作用，改變其作為正常模版的功能，引起DNA復制障礙，從而抑制癌細胞分裂。

目前，卵巢癌的化療療效并不十分理想，致使卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊不前，因此，如何提高卵巢癌化療的敏感性成為治療卵巢癌的關鍵，也成為臨床上迫切需要解決的問題。基于上述已有的科學技術研究成果，本研究選擇HIF－1α基因作為靶點，將載體系統引入卵巢癌細胞中，并使之長期穩定表達以沉默HIF－1α基因，通過RNA干擾技術有效地下調了卵巢腫瘤細胞中HIF－1α基因和蛋白的表達水平，誘導和促進了卵巢癌細胞的凋亡，在分子水平上阻斷了卵巢癌細胞的生長和轉移，為卵巢癌基因治療與化學治療相結合提供了實驗依據，也為進一步提高卵巢癌患者的生存率提供一條新的治療途徑。

［1］劉亦晴，張建文，陳奎生，等.皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞癌組織中 HIF－1α、VEGF的表達［J］.鄭州大學學報：醫學版，2007，42（2）：340.

［2］王勇梅，吳維光，葛紅雨，等.沉默STAT3基因對人卵巢癌化療敏感性的影響［J］.中國癌癥雜志，2010，20（4）：270.

［3］Wong Ch，Theresa L，Karen H，et al.VEGF and HIF－1expression are increased in sdvanced stages of epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2003，91（3）：513.

［4］Shimogai R，Kigawa J，Itamochi H，et al.Expression of hypoxiainducible factor 1alpha gene affects the outcome inpatients with ovarian cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2008，18（3）：499.

［5］Argyriou P，Papageorgiou S G，Panteleon V，et al.Hypoxiainducible factors in mantle cell lymphoma：implication for anactivatedmTORC1→HIF－1αpathway［J］.Ann Hematol，2011，90（3）：315.

［6］Brummelkamp TR，BernardsR，AgamiR.A ststem for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.Science，2002，296（5567）：550.