胰島素樣生長因子1對于實驗性動脈粥樣硬化斑塊細胞組織結(jié)構(gòu)的影響

劉 洋，許金鵬，劉福林

（1．保定市第二醫(yī)院 心外科，河北 保定071000；2．河北大學(xué)附屬醫(yī)院心臟科，河北 保定071000）

動脈粥樣硬化是造成心腦血管疾病的根本原因。臨床工作中，大量發(fā)生急性心血管事件的患者提前沒有任何可供預(yù)警的癥狀體征。研究認為，急性心血管事件的發(fā)生絕大多數(shù)是由于動脈粥樣硬化斑塊破裂誘發(fā)血栓形成造成的，在急性冠脈綜合征的發(fā)生原因中，斑塊破裂約占60%－75%，斑塊潰瘍約占25%－40%，鈣化小結(jié)約占2%－7%［1，2］，這種易于破裂的斑塊稱為“易損斑塊”。

胰島素樣生長因子1（Insulin－like growth factor 1，IGF－1）是一種受生長激素調(diào)節(jié)，與胰島素原有高度同源性的單鏈多肽類生長因子。動脈粥樣硬化形成過程中涉及的炎癥細胞、血管平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞均可分泌IGF－1。IGF－1能夠改變細胞周期進程，抑制血管SMC凋亡，誘導(dǎo)SMC增殖，從而穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，降低其易損性，理論上可以起到抑制動脈粥樣硬化的作用。

易損斑塊的診斷與治療一直是臨床及科研工作的熱點與難點，本研究旨在探討應(yīng)用IGF－1對于動脈粥樣硬化斑塊細胞成分的影響，為其應(yīng)用于控制斑塊易損性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動脈粥樣硬化動物模型的制備 雄性新西蘭大白兔18只，隨機分為3組，每組6只，分別為模型組、IGF－1干預(yù)組、辛伐他汀干預(yù)組。3組動物每天均給予高脂飼料并行球囊拉傷，制作動脈粥樣硬化模型。麻醉實驗動物，解剖分離股動脈。取4F Forgaty球囊插入股動脈。上行插入約30cm，向球囊內(nèi)注入生理鹽水，向下拖拉球囊至髂總動脈分叉處，反復(fù)3次。撤出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈，縫合組織及皮膚。術(shù)后繼續(xù)給予動物高脂飼料喂養(yǎng)10周，同時IGF－1干預(yù)組每天給予0．1mg／ml的IGF－1因子1ml腹腔注射，辛伐他汀干預(yù)組給予辛伐他汀懸濁液2．5mg／kg灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃。

1．2 取材 注射過量麻醉劑處死實驗動物，解剖取出主動脈固定，縱向剖開動脈，可見動脈粥樣硬化斑塊均勻分布于膈下至髂動脈分叉處，按動物分組做好相應(yīng)標識備用。

1．3 標本病理組織結(jié)構(gòu)測量 兔主動脈標本固定后，選擇動脈粥樣硬化斑塊最明顯節(jié)段，石蠟包埋動脈片段，梯度系列乙醇組織脫水，連續(xù)5μm厚度切片，固定在玻片上。組織切片用HE染色，使用NIKON NIS－ELements2．30圖像分析系統(tǒng)采集分析圖像，每個斑塊至少取10處測量纖維帽厚度取平均值，測量處包括最厚與最薄處，測量每個斑塊纖維帽厚度與相對應(yīng)脂核橫截面厚度。

1．4 免疫組化測定 應(yīng)用ELISA法進行α－actin單克隆抗體標定平滑肌細胞。每例斑塊標本取4張免疫組化切片，進行平滑肌細胞肌動蛋白免疫組化檢測，顯微鏡觀察，選擇實驗組和對照組的陽性和陰性組織相、進行400×的顯微照相，棕黃色為陽性表達，選擇有意義的組織相，采用多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司Image－Pro Plus）進行分析觀察，讀取結(jié)果。

1．5 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS16．0軟件包，結(jié)果以（ˉx±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 斑塊組織結(jié)構(gòu)特點

2．1．1 斑塊大體組織學(xué)結(jié)構(gòu) 肉眼觀兔腹主動脈膈水平以下有明顯的連續(xù)性動脈粥樣硬化斑塊，按照AHA動脈粥樣硬化分型，可將斑塊分為六型：1型（初始病變），Ⅱ型（脂質(zhì)條紋病變），Ⅲ型（中間型病變），Ⅳ型（粥樣瘤病變），Ⅴ型（纖維粥樣瘤病變），Ⅵ型（Ⅴ型合并并發(fā)病變）。鏡下見各組斑塊表現(xiàn)為Ⅳ型及Ⅴ型斑塊特點，斑塊表面覆蓋纖維帽不明顯，斑塊內(nèi)平滑肌細胞和膠原含量相對較少。模型組斑塊纖維帽較薄，脂核相對較大，而干預(yù)組斑塊纖維帽較厚，脂核相對較小。

2．1．2 測量斑塊纖維帽厚度，脂核厚度，并計算纖維帽厚度與脂核橫截面厚度的比值。IGF－1組與模型組比較，在斑塊肩部及頂部，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；辛伐他汀組與模型組比較，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，辛伐他汀組與IGF－1組，兩者帽核比均大于模型組帽核比。而IGF－1組與 辛伐他汀組比較，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表1。

表1 各組間斑塊帽核比（ˉx±s）

2．2 平滑肌細胞免疫組化

2．2．1 病理切片由一名專業(yè)人員獨立閱片，相關(guān)指標定量使用免疫組化評分（IHS）。已證明，此種方法得出的數(shù)據(jù)近似于圖像分析為基礎(chǔ)的評分系統(tǒng)［3］。IHS包含了免疫反應(yīng)陽性細胞百分比分級（質(zhì)量評分）與陽性細胞顯色強度分級（染色強度評分），結(jié)合兩方面綜合計算進行評分。陽性細胞百分比0－1% ＝0；1%－10% ＝1；10%－50% ＝2；50%－80%＝3；80%－100%＝4。陽性細胞顯色強度分別為0（陰性）；1（弱陽性）；2（陽性）；3（強陽性）。IHS評分為兩者評分的乘積，故評分范圍為0到12。IHS評分9－12為強免疫反應(yīng)，5－8為中等免疫反應(yīng)，1－4為弱免疫反應(yīng)，0為無免疫反應(yīng)。

2．2．2 平滑肌細胞免疫組化評分（IHS）見表2。模型組平滑肌細胞含量明顯較少（圖1A），而IGF－1干預(yù)組、辛伐他汀干預(yù)組平滑肌細胞含量相對較多（圖1B）。由表2可見，兩干預(yù)組平滑肌細胞含量均與模型組有統(tǒng)計學(xué)差異，而辛伐他汀組平滑肌細胞含量增多趨勢最明顯。

表1 各組間斑塊平滑肌細胞免疫組化IHS（ˉx±s）

圖1 平滑肌肌動蛋白抗體主要在細胞漿表達（×400）

3 討論

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠心病和缺血性腦卒中等急性心腦血管事件的主要原因。目前的研究認為，決定患者是否易于發(fā)生急性血管事件的關(guān)鍵因素是斑塊的穩(wěn)定性，而不是簡單的斑塊體積大小［4］。動脈粥樣硬化比較嚴重的患者并不一定發(fā)生急性血管事件，相反，某些僅造成輕／中度管腔狹窄的斑塊更易于破裂誘發(fā)血栓形成，這種斑塊被稱為易損斑塊。易損斑塊通常脂質(zhì)核心相對較大，而纖維帽相對較薄，更容易發(fā)生破裂、潰瘍和糜爛，這些病理改變的直接后果是引發(fā)血小板瀑布反應(yīng)，造成血小板聚集形成血栓。所以，早期進行藥物或其他干預(yù)，改善動脈粥樣硬化斑塊的易損性，具有非常明顯的臨床與社會意義。

胰島素樣生長因子1是一種受生長激素調(diào)節(jié)，與胰島素原有高度同源性的單鏈多肽類生長因子［5，6］。動脈粥樣硬化形成過程中涉及的炎癥細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞均可分泌IGF－1［7，8］。IGF－1能夠改變細胞周期進程，抑制血管SMC凋亡，誘導(dǎo)SMC增殖。Ruiz等人的體外實驗顯示［9］，IGF－1通過與受體結(jié)合可以刺激血管平滑肌細胞的增殖和遷移，影響動脈粥樣硬化的進程。SMC可產(chǎn)生膠原，膠原對維持纖維帽的張力和強度非常重要［10］，SMC凋亡會減少膠原產(chǎn)生，從而減弱這種保護作用，使斑塊極不穩(wěn)定易于破裂。從這個角度而言，IGF－1可以用于改善動脈粥樣斑塊的易損性。

本研究中，平滑肌細胞免疫組化提示，IGF－1組的平滑肌細胞較模型組增多。所以，應(yīng)用IGF－1可以誘導(dǎo)平滑肌細胞增殖，影響斑塊的組織機構(gòu)，使易損斑塊的纖維帽厚度得到加強，從而使斑塊破裂的可能性下降，達到穩(wěn)定斑塊的目的。他汀類降脂藥對于動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定作用已得到大量基礎(chǔ)及臨床試驗的證實。本研究中，IGF－1組與他汀組在改善斑塊結(jié)構(gòu)方面無明顯差異，但是總體趨勢并不優(yōu)于他汀，在調(diào)整IGF－1應(yīng)用劑量及使用途徑后是否能夠優(yōu)于他汀類藥物，是本研究未來將要探索的方向之一。

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