c－Met蛋白、端粒酶在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

曹 揚(yáng)，張玫娜，郭志鵬，王廣義

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021）

原發(fā)性肝癌（primary liver carcinoma，PLC）是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)主要高發(fā)于東南沿海地區(qū)。死亡率高，在我國(guó)惡性腫瘤中死因排第二位．肝癌死亡率呈升高態(tài)勢(shì)，但標(biāo)化死亡率已顯示升高幅度趨緩．肝癌防治應(yīng)當(dāng)繼續(xù)成為我國(guó)腫瘤防控的重點(diǎn)［1］。癌細(xì)胞的永生化是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特征，也是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。端粒酶（Telomerase）是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，目前大量的研究證明腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性與其細(xì)胞的無(wú)限增殖存在密切的關(guān)系。人端粒酶催化亞單位（human telomer－ase reverse transcriptasc hTERT）是端粒酶組成成分之一，且hTERT的表達(dá)與端粒酶的活性呈平行關(guān)系［2，3］。已知c－Met蛋白是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （hepatocyte growth factor，HGF）的單一受體，研究證明其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。然而目前尚未有研究表明肝細(xì)胞癌中端粒酶與c－Met蛋白的表達(dá)是否具有相關(guān)性，故本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)42例肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma HCC）和 10 例 癌 旁 細(xì) 胞 中 c－Met蛋 白 和hTERT基因蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析二者在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義和相關(guān)性，進(jìn)而探討二者對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響，為臨床肝細(xì)胞癌的診斷治療和預(yù)后判定提供理論依據(jù)

1 對(duì)象與方法

1．1 標(biāo)本

肝細(xì)胞癌標(biāo)本42例，為2007－2010年吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科存檔的肝細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本。其中男性：26例，女性16例；年齡30－79歲，平均60．8歲；有包膜：19例，無(wú)包膜23例；肝硬化：34例；乙肝表面抗原陽(yáng)性（HBsAg）：36例；有肝內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移32例，無(wú)轉(zhuǎn)移10人。另取10例肝細(xì)胞癌癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1．2 主要試劑

兔抗人TERT端粒酶（bs－0233R）多克隆抗體及兔抗人c－met／HGFR（bs－0668R）多克隆抗體，免疫組化染色試劑盒（SP－0023）和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

嚴(yán)格按S－P免疫組化染色檢測(cè)試劑盒所附操作程序進(jìn)行操作。

1．4 結(jié)果判斷

c－Met蛋白以胞漿和胞膜染成黃色或棕黃色；hTERT以細(xì)胞核和／或細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。每張切片與高倍鏡（10×20）隨機(jī)取5個(gè)視野，分別觀察兩者陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性率。先按染色強(qiáng)度（a）如下評(píng)分：無(wú)色為0分；淺黃為1分；黃為2分；棕黃為3分。然后再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比b（%）評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞5%－25%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞26%－50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞51%－75%為3分；陽(yáng)性細(xì)胞＞75%為4分。結(jié)果分析：a×b在0分計(jì)（－）；0－2分計(jì)為（＋）；2－6分計(jì)為（＋＋）；6－12分計(jì)為（＋＋＋）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

陽(yáng)性率組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)分組資料組間比較采用非參秩和檢驗(yàn)分析，相關(guān)分析用非參數(shù)相關(guān)（Spearman）分析，采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)

c－Met蛋白和hTERT在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為76．19%和88．09%，對(duì)照組分別為30%和40%。兩組間陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表1，圖1。

表1 c－Met、hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)比較

2．2 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

行Sperman相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)為r＝0．140，兩者之間無(wú)相關(guān)性（P＞0．05），見(jiàn)表2。

表2 c－Met、hTERT在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)的相關(guān)性

2．3 c－Met蛋白和hTERT的表達(dá)與肝細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

c－Met的表達(dá)與性別、年齡、肝硬化及 HBsAg無(wú)關(guān)（P＞0．05），與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0．05）；hTERT與性別、年齡、腫瘤的轉(zhuǎn)移及HBsAg均無(wú)關(guān)（P＞0．05），與肝硬化有關(guān)（P＜0．05），見(jiàn)表3。

表3 c－Met和hTERT的表達(dá)與肝細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

2．4 c－Met在hTERT陽(yáng)性和陰性的肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)

hTERT陽(yáng)性肝細(xì)胞癌組織中c－Met（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）和（－）分別為15、9、5和8例。hTERT陰性肝細(xì)胞癌組織中c－Met（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）和（－）分別為0、2、1和2例。兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），見(jiàn)表4。

2．4 c－Met在hTERT陽(yáng)性和陰性的肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)

圖1 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞有別于正常組織細(xì)胞其一在于細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程主要包括：腫瘤細(xì)胞自身的黏附性降低、瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用即基質(zhì)溶解和移動(dòng)、瘤細(xì)胞從原位點(diǎn)沿著缺損的ECM向周圍侵襲或進(jìn)入淋巴管、血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［4］。研究認(rèn)為 HGF／c－Met蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使β2連環(huán)蛋白的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，使之不能與E2鈣粘蛋白胞內(nèi)部分結(jié)合形成復(fù)合體，阻礙了E2鈣粘蛋白和細(xì)胞骨架的連接作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附作用減弱。基質(zhì)金屬蛋白酶－9（Matrix metalloproteinases－9，MMP－9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要一員，又稱明膠酶B，大量的能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，Abounader R等［5］研究認(rèn)為 HGF／c－Met蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可誘導(dǎo)MMP－9的生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示c－Met蛋白的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。Maulik G 等研究也認(rèn)為HGF與其受體c－Met結(jié)合并啟動(dòng)該受體酪氨酸激酶的活性，進(jìn)而啟動(dòng)ECM的降解最終參與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)［6］。

研究認(rèn)為腫瘤血管形成是惡性腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，當(dāng)腫瘤組織生長(zhǎng)到直徑大于1－2mm時(shí)，其進(jìn)一步生長(zhǎng)需要新生血管為其提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤血管形成是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)HGF可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有誘導(dǎo)血管生成的作用；并且可以通過(guò)自分泌和旁分泌的形式與c－Met相結(jié)合直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞或影響其他血管生長(zhǎng)因子（如VEGF、bFGF）的表達(dá)和分泌，間接促進(jìn)血管的生長(zhǎng)。還有研究認(rèn)為受到 HGF活化的c－Met蛋白受體動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、形成血管樣結(jié)構(gòu)［7，8］。

腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常組織細(xì)胞其二在于細(xì)胞的無(wú)限增殖永生能力。大量研究表明，細(xì)胞獲得永生能力與端粒酶的激活密切相關(guān)，由于端粒酶的激活，使端粒的長(zhǎng)度維持一種動(dòng)態(tài)平衡，使腫瘤細(xì)胞獲得無(wú)限制增殖的能力。端粒酶活化是腫瘤發(fā)生的一個(gè)顯著的生物學(xué)特征［9］。端粒酶主要由兩部分組成：模板RNA和hTERT，后者以前者起逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，后者與細(xì)胞端粒酶活性高低密切相關(guān)，hTERT的變化可較準(zhǔn)確的反映細(xì)胞中端粒酶活性的變化［10］。本實(shí)驗(yàn)hTERT在肝細(xì)胞癌組織和癌旁中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為88．09%和40%。兩組間陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c－Met蛋白與端粒酶的表達(dá)無(wú)相關(guān)性r＝0．140（P＞0．05），但端粒酶陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌中c－Met蛋白的表達(dá)量要明顯的多于端粒酶陰性的肝細(xì)胞癌組織（P＞0．05）。此結(jié)果側(cè)面的反應(yīng)了端粒酶陽(yáng)性的肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力要明顯的強(qiáng)于端粒酶陰性的肝細(xì)胞癌組織。因此對(duì)二者定量的檢測(cè)可能給臨床的治療及預(yù)后帶來(lái)一定的指導(dǎo)意義。

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