JNK信號通路對NaAsO2誘導NIH3T3細胞中hnRNP K蛋白聚集體形成的影響*

樊啟黃， 姜 楓， 胡水旺， 唐昭亮， 姜 勇

(南方醫科大學病理生理學教研室，廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

JNK信號通路對NaAsO2誘導NIH3T3細胞中hnRNP K蛋白聚集體形成的影響*

樊啟黃▲， 姜 楓▲， 胡水旺， 唐昭亮， 姜 勇△

(南方醫科大學病理生理學教研室，廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣東 廣州 510515)

目的觀察核不均一核糖核蛋白(hnRNP)K的表達與定位以及亞砷酸鈉(NaAsO2)刺激NIH3T3細胞的反應情況及氧化應激變化，探討JNK信號通路在hnRNP K蛋白聚集體形成中的作用。方法構建重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA，轉染NIH3T3細胞，熒光顯微鏡觀察內源性hnRNP K在細胞中的表達與定位，以及在NaAsO2不同刺激時間該蛋白聚集體的形成情況，并利用活性氧(ROS)檢測試劑盒測定胞內ROS水平；給予JNK、MEK、PI3K/Akt、NF-κB和核轉運等5種信號通路的抑制劑預處理后，觀察聚集體的變化情況。結果重組質粒構建正確，熒光顯微鏡觀察顯示hnRNP K主要定位于胞核中，而重組質粒轉染NIH3T3細胞后，可見胞內有蛋白聚集體形成并隨NaAsO2刺激時間的延長而遞增，且過表達hnRNP K可抑制NaAsO2刺激細胞生成ROS；JNK信號通路抑制劑SP600125明顯抑制聚集體的形成。結論hnRNP K主要定位在NIH3T3細胞的胞核中，胞漿少量分布；NaAsO2可誘導NIH3T3細胞形成hnRNP K蛋白聚集體，此聚集體可抑制胞內ROS生成，且該聚集體的形成有賴于JNK介導的信號通路。

核不均一核糖核蛋白K； 亞砷酸鈉； 聚集體； JNK信號通路

核不均一核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, hnRNP K)是一種進化高度保守的核內RNA結合蛋白，屬于核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)家族成員之一[1]。該蛋白家族是存在于真核生物體內的一種多功能蛋白，目前已發現大約20種(A～U)，它們具有類似的結構特征和胞內分布。研究表明，hnRNPs在多種生物學過程中擔當重要角色，如新合成的mRNA前體經過加工剪接，才能成為成熟的mRNA，此過程受特異的hnRNPs所調控；hnRNP A2/B1可用于肺癌輔助診斷的標志[2]。hnRNP K與其它hnRNPs相比有不同的結構特征，它含有3個與DNA-RNA結合的KH結構域(K homology domain)KH1、KH2和KH3，1個KI域(K interactive region)和1個C端蛋白激酶連接域，這與hnRNP K的許多生物學功能息息相關,如調節基因的轉錄和翻譯[3]，參與細胞周期、細胞凋亡及腫瘤轉移等細胞生物學功能調節[4]，同時，在信號轉導調控中發揮重要作用[5-6]。hnRNP K的研究多集中在肝癌、肺癌、慢性髓細胞白血病等惡性腫瘤中，而在如氧化應激、慢性炎癥等相關研究中并未深入。Toshiyuki等[7]研究顯示，熒光顯微鏡下可觀察到hnRNP K與其結合蛋白RNA結合基序蛋白42(RNA-binding motif protein 42, RBM42)，均可在亞砷酸鹽刺激MTD-1 A細胞后形成應激顆粒(stress granules, SGs)，且共定位于SGs中，相互獨立存在。因此，本研究想通過構建hnRNP K真核表達載體，轉染NIH3T3細胞，過表達hnRNP K蛋白，熒光顯微鏡觀察亞砷酸鈉(sodium arsenite, NaAsO2)刺激細胞的反應情況，并進一步探討該現象是否與氧化應激以及應激信號通路相關。這些將為我們進一步認識hnRNP K在細胞內的相關生物學功能奠定基礎。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級6～8周C57/BL6小鼠(南方醫科大學動物所)；CO2培養箱(Heraeus)；熒光顯微鏡(Zeiss)；SpectraMax M5 型酶標儀(Molecular Devices)；Petri皿和細胞培養皿(Corning)；真核表達載體pcDNA3-HA、腸桿菌菌株DH5α和NIH3T3細胞系(本室保存)；DNA ladder和Taq DNA聚合酶(TaKaRa)；限制性內切酶、High DNA連接酶(TaKaRa)；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(Axygen)，RNeasy Mini Kit、RT-PCT兩步法試劑盒和LipofectamineTM2000轉染試劑盒(Invitrogen)；DMEM培養液和胎牛血清(HyClone)；血凝素(hemagglutinin,HA)抗體(Cell Signaling Technology)；hnRNP K兔源抗體(Bioworld Technology)，Alexa Fluor 488偶聯的抗兔IgG和Alexa Fluor 594偶聯的抗鼠IgG(Molecular Probes)；活性氧檢測試劑盒(碧云天公司)，其它試劑均為國產分析純。引物合成由華大基因公司完成。

2方法

2.1小鼠肝臟組織總RNA的提取及逆轉錄 摘除C57/BL6小鼠眼球，放血處死，迅速取出1/4肝小葉組織，液氮速凍下研磨，加入約1 mL Trizol，用Trizol法提取總RNA。以制備的總RNA為模板，按照Toyobo RT-PCR兩步法試劑盒操作說明進行RT-PCR反應獲得小鼠的cDNA。

2.2pcDNA3-hnRNP K-HA重組質粒的構建 設計含有KpnI和EcoR I酶切位點的上、下游引物，以RT-PCR得到的hnRNP K cDNA為模板，擴增得到帶有酶切位點的hnRNP K編碼序列。上游引物5’-TT GGTACCATGGAGACCGAACAGCC-3’，下游引物5’-CGGAATTCGAAAAACTTTCCAGAATACTGCTT-3’，不含終止密碼子。以Taq DNA聚合酶進行PCR反應。反應條件：94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后，用KpnI和EcoR I進行雙酶切，載體pcDNA3-HA也同時采用KpnI和EcoR I進行雙酶切，酶切產物經凝膠電泳回收后，用High DNA連接酶37 ℃連接2 h。連接產物轉化DH5α感受態菌并接種到含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養板，37 ℃孵箱培養12 h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃振搖過夜。小量提取質粒，分別進行菌液PCR、酶切及測序鑒定，構建質粒命名為pcDNA3-hnRNP K-HA。

2.3脂質體介導的瞬時轉染及表達 NIH3T3細胞用含10% FBS的DMEM，于5% CO2、37 ℃孵箱中培養。轉染前18～24 h，將1×105細胞鋪于3.5 cm皿中，待細胞長至約70%融合時，用PBS洗3次，加入400 μL含有10% FBS的培養基，然后，分別將1.0 μg重組質粒pcDNA3-hnRNP K-HA和空載體質粒pcDNA3-HA(對照)用Opti-MEM無血清培養基稀釋至終體積50 μL，轉染試劑則按LipofectamineTM2000∶質粒為1∶3，溶于50 μL Opti-MEM，混勻后室溫靜置5 min，將分別含有質粒和轉染試劑50 μL Opti-MEM充分混勻后的，于室溫下孵育20 min。最后將100 μL含有DNA轉染復合物的培養基加入上述3.5 cm皿中。細胞置于5% CO2、37 ℃孵箱中繼續培養4～6 h后，PBS洗3次，加入2 mL含有10% FBS的培養基，于孵箱中繼續培養至24 h。

2.4Western blotting檢測 NIH3T3細胞轉染24 h后收集細胞，Ⅰ抗anti-HA(1∶1 000)和anti-β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育過夜后，與1∶6 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的抗鼠IgG室溫孵育70 min，用Pierce公司的SuperSignal West Pico化學發光底物進行顯色，并在Kodak IS4000R圖像工作站上采集圖像。

2.5細胞免疫化學檢測

2.5.1檢測內源性hnRNP K定位實驗 接種1×104細胞至Petri皿中，12 h后補液，置于孵箱中繼續培養至24 h左右，棄去細胞培養上清，150 μL PBS洗滌3次，每次5 min；4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3次；含0.1% Triton X-100的PBS(PBST)透化細胞膜5 min，PBS洗3次；3% BSA封閉2 h，PBST洗3次，然后用1% BSA稀釋hnRNP K兔源抗體(1∶200)孵育2 h，PBST洗3次；用1% BSA稀釋Alexa Fluor 488偶聯的抗兔IgG(1∶6 000)室溫孵育1 h，PBST洗3次；50 mg/L DAPI(1∶200)染核，用PBS稀釋，室溫染色15 min，PBS洗3次；于Zeiss熒光顯微鏡下觀察和圖像采集。

2.5.2NaAsO2刺激實驗 接種轉染空載體pcDNA3和重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA的NIH3T3細胞，按每皿1×104細胞鋪至Petri皿中，12 h后補液，置于孵箱中繼續培養至24 h左右，待細胞密度長到80%時換用無血清DMEM培養8 h，實驗組分別給予200 μmol/L NaAsO2刺激0 min、15 min、30 min和60 min，免疫染色步驟同上，Ⅰ抗用1% BSA稀釋HA-Tag特異性抗體(1∶200)孵育，Ⅱ抗用1% BSA稀釋Alexa Flour 594偶聯的抗鼠IgG(1∶6 000)孵育。

2.5.3通路抑制劑預處理實驗 接種轉染空載體pcDNA3和重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA的NIH3T3細胞，按每皿1×104細胞鋪至Petri皿中，12 h后補液，置于孵箱中繼續培養至24 h左右，待細胞密度長到80%時換用無血清DMEM培養8 h，實驗組采用JNK、MEK、PI3K/Akt、NF-κB以及核轉運等5種信號通路抑制劑[依次為： SP600125(200 nmol/L)、PD98059(200 nmol/L)、wortmannin(200 nmol/L)、BAY11-7082(5 μmol/L)和WGA(20 μg/L)]預處理轉染后的NIH3T3細胞1 h，再給予200 μmol/L NaAsO2刺激1 h，免疫染色步驟同上。

2.6ROS的檢測 按步驟2～3脂質體介導轉染的方法，培養2個3.5 cm皿NIH3T3細胞，分別轉染空質粒pcDNA3和重組質粒pcDNA3-hnRNP K-HA，轉染24 h后，分別消化細胞，以每孔1×104接種于Costar? 96孔板內，共設立6組：轉染空質粒、轉染重組質粒和未轉染細胞并分別依次給予NaAsO2刺激0 min、30 min和60 min；陽性對照組(試劑盒中陽性刺激物ROSup處理)，另設空白對照組(不鋪細胞，給予DCFH-DA探針孵育)，每組做3個復孔。其中，實驗組給予200 μmol/L NaAsO2刺激細胞，而陽性對照組加入1∶1 000 ROSup稀釋液刺激。接著應用ROS檢測試劑盒，按照1∶1 000用無血清的培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，每孔100 μL稀釋液，37 ℃細胞培養箱中孵育30 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用SpectraMax M5型酶標儀，在488 nm激發波長、525 nm發射波長處檢測細胞內平均熒光強度。

3統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件處理。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(least significant difference, LSD)-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1pcDNA3-hnRNPK-HA重組質粒的鑒定

構建的重組質粒菌液經PCR擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳可見1 400 bp左右的DNA片段，與插入的DNA序列大小相符，經KpnI和EcoR I雙酶切后可見5.4 kb和1 400 bp左右的2個條帶，符合預期大小，見圖1。DNA測序結果顯示，重組質粒pcDNA3-hnRNP K-HA構建正確。

Figure 1. Identification of pcDNA3-hnRNP K-HA fusion protein expression vector by agarose gel electrophoresis. M: 1 kb marker; 1: pcDNA3-HA digested byKpnI andEcoR I; 2: hnRNP K coding sequence digested byKpnI andEcoR I; 3: amplified hnRNP K from pcDNA3-hnRNP K-HA.

圖1pcDNA3-hnRNPK-HA融合蛋白表達載體的電泳鑒定

2Westernblotting檢測hnRNPK-HA融合蛋白的表達

pcDNA3-hnRNP K-HA重組質粒在NIH3T3細胞中可有效表達，且帶HA標簽的融合蛋白分子量約58 kD，與小鼠hnRNP K分子量相近，見圖2。

Figure 2. Expression of hnRNP K-HA fusion protein in NIH3T3 cells detected by Western blotting. 1: un-transfected cells; 2: cells transfected with empty vector; 3: cells transfected with recombinant vector.

圖2Westernblotting檢測hnRNPK-HA在NIH3T3細胞內的表達

3hnRNPK在NIH3T3細胞中的表達與定位

細胞免疫熒光結果顯示內源性hnRNP K主要定位于胞核中，胞漿中有少量分布，見圖3。

Figure 3. The expression and localization of hnRNP K in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600).

圖3hnRNPK在NIH3T3細胞中的表達與定位

4NaAsO2誘導NIH3T3細胞hnRNPK蛋白聚集體的形成

免疫細胞化學檢測顯示，外源性hnRNP K在NIH3T3細胞中有表達，過表達的蛋白在胞漿胞核中均有分布，主要分布在胞漿中。轉染空載體質粒pcDNA3的NIH3T3細胞內未檢測到標記的蛋白熒光信號，正常情況下，融合蛋白呈彌散性分布在胞漿和胞核中，而NaAsO2刺激后，細胞內有較為明顯的紅色熒光聚集體的形成，并隨時間的延長而遞增。15 min后無明顯變化，30 min形成微小顆粒狀物，60 min形成的微小聚集體更為明顯，見圖4。

5hnRNPK抑制NIH3T3細胞ROS的生成

陽性對照組ROSup刺激細胞后，胞內ROS水平明顯上升。未轉染重組載體的實驗組中，NaAsO2刺激30 min和60 min與未刺激組相比差異均具有統計學意義(P<0.01)，而轉染重組載體后，細胞內ROS水平上升趨勢減緩，NaAsO2刺激60 min同未轉染實驗組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。這些結果表明，NaAsO2誘導NIH3T3細胞產生ROS，而hnRNP K降低細胞內ROS生成水平。

6NaAsO2誘導NIH3T3細胞hnRNPK蛋白聚集體的形成依賴于JNK通路

由于外源性hnRNP K在200 μmol/L NaAsO2刺激1 h時，NIH3T3細胞中蛋白聚集體的形成最多且最為明顯，因此，選擇1 h為NaAsO2刺激時間，使用SP600125、PD98059、wortmannin、BAY11-7082和WGA等5種抑制劑預處理細胞1 h后，檢測對細胞內蛋白聚集體形成的影響。給予JNK通路特異性抑制劑SP600125預處理后，細胞中的蛋白聚集體明顯解聚，呈彌散分布，恢復到了靜息狀態下水平，而給予MEK抑制劑PD98059、PI3K/Akt抑制劑wortmannin、NF-κB抑制劑BAY11-7082以及出核轉運抑制劑WGA預處理細胞，NaAsO2刺激1 h后，細胞內的蛋白聚集體無明顯變化。SP600125可抑制NaAsO2誘導NIH3T3細胞hnRNP K蛋白聚集體的形成，提示該聚集體的形成依賴于JNK信號通路，見圖6。

Figure 4. NaAsO2stimulated the formation of hnRNP K-HA fusion protein aggregates in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600). Control: NIH3T3 cells transfected with pcDNA3; 0 min, 15 min, 30 min and 60 min: cells were transfected with pcDNA3-hnRNP K-HA, and stimulated with 200 μmol/L NaAsO2for 0, 15, 30 and 60 min, respectively.

圖4NaAsO2刺激NIH3T3細胞hnRNPK-HA融合蛋白聚集體的形成

Figure 5. hnRNP K suppressed intracellular ROS generation in NIH3T3 cells.NC: negative control; PC: positive control, cells stimulated with ROSup; EV: cells transfected with empty vector; 0 min, 30 min and 60 min: cells were transfected with recombinant vector, and stimulated with 200 μmol/L NaAsO2for 0, 30 and 60 min, respectively. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 min;*P<0.05vsnon-transfection.

圖5hnRNPK抑制NIH3T3細胞內ROS生成

討 論

研究表明，hnRNP K參與染色體的重塑，轉錄調節以及細胞內信號轉導，目前已發現多種腫瘤的發生、發展和轉移都與該家族蛋白有關，且已有研究證實hnRNP K在胰腺癌[8]、肺癌[9]、前列腺癌[10]等多種腫瘤細胞和組織中呈高表達，主要通過調控與細胞增殖有關基因的表達而影響腫瘤的發生發展。由此可見，包括hnRNP K在內的hnRNPs家族成員在各種腫瘤發生、發展與轉移密切相關，因此，研究hnRNPs蛋白家族參與氧化應激反應的分子機制，對于我們認識其與氧化應激相關的各種疾病具有重要意義。

本研究中，細胞免疫化學實驗結果顯示，內源性hnRNP K蛋白主要定位于胞核中，而在轉染重組質粒的NIH3T3細胞中，融合蛋白主要表達定位于胞漿中，且NaAsO2不同時間刺激后，細胞內出現紅色熒光聚集體，胞漿中的融合蛋白以聚集體形式呈點狀分布，且隨刺激時間的延長有遞增趨勢。蛋白聚集體被認為是細胞的一種防御反應，通常細胞中錯誤折疊蛋白會被蛋白酶體降解，但在熱應激、氧化應激等環境因素作用下，一些錯誤折疊蛋白質不被降解，反而會形成蛋白聚集體[11]。它與許多疾病，如神經退行性疾病包括肌萎縮側索硬化、阿爾茲海默氏癥和瘋牛病等關系密切[12]。其中，有研究發現，真核細胞在受環境刺激如氧化應激、熱休克、紫外照射時，在胞質中會形成致密顆粒狀聚合體，即SGs。SGs 可以在壓力情況下作為mRNA 的儲存場所，當應激解除時，SGs解聚，mRNA從SGs中釋放出來，可以繼續參與翻譯[13-14]。因此，本實驗中所觀察到的蛋白聚集體，是否為SGs，還需進行進一步驗證。

Figure 6. Effects of five different pathway inhibitors on the formation of hnRNP K protein aggregates in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600).

圖65種不同通路抑制劑預處理NIH3T3細胞對hnRNPK蛋白聚集體形成的影響

研究發現，當細胞處于應激狀態時，細胞質中hnRNP A1出現大量的積累，呈現高磷酸化狀態，從而影響細胞內的轉錄調節，這一過程可能與p38應激信號轉導通路及其下游信號通路有關[15]。Yang等[16]研究表明，hnRNP A18也參與了細胞應激的調控，在hnRNP A18過表達時，可以減少紫外線照射對細胞的殺傷程度，而抑制hnRNP A18的表達時，細胞對于紫外線殺傷的敏感性增加，可見hnRNP A18對細胞應激狀態也有重要的保護作用。而hnRNP K與hnRNP A1/A18隸屬于同一家族蛋白，它是否也參與了某種信號通路的調控呢？本實驗中，NaAsO2誘導NIH3T3細胞hnRNP K形成的蛋白聚集體，受到JNK特異性抑制劑SP600125的抑制作用。而JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一員，許多外界應激因素(如物理射線、熱休克、氧化損傷)等都能激活JNK，因此JNK為介導應激過程的重要激酶分子[17]，大量實驗研究顯示JNK信號通路在細胞分化、細胞凋亡、應激反應以及多種疾病的發生與發展中起著至關重要的作用。因此，本研究中，NaAsO2誘導NIH3T3細胞內hnRNP K蛋白聚集體的形成，且過表達hnRNP K可拮抗NaAsO2刺激細胞產生ROS水平，兩者可能存在某種關系，進一步研究發現該聚集體的形成依賴于JNK信號通路。總之，這些為我們進一步探討hnRNP K與氧化應激損傷等相關生物學功能奠定了實驗基礎。因此，進一步明確JNK是如何影響hnRNP K蛋白聚集體形成的機制，進而探索其相關生物學功能具有重要意義。

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EffectsofJNKsignalingpathwayonhnRNPKproteinaggregatesinNIH3T3cellstreatedwithsodiumarsenite

FAN Qi-huang, JIANG Feng, HU Shui-wang, TANG Zhao-liang, JIANG Yong

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:jiang48231@163.com)

AIM: To explore the role of JNK signaling pathway in the formation of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) K protein aggregates by observing the expression and localization of hnRNP K in NIH3T3 cells induced by sodium arsenite(NaAsO2).METHODSThe recombinant vector pcDNA3-hnRNP K-HA was constructed and transfected into NIH3T3 cells. The expression and localization of endogenous hnRNP K and distribution of the protein aggregates stimulated with NaAsO2at different time points were observed under fluorescence microscope. The level of reactive oxygen species (ROS) in the cells was detected by a ROS assay kit. After pretreated with the inhibitors of 5 signaling pathways (JNK, MEK, PI3K/Akt, NF-κB and nuclear transport), the changes of the protein aggregates were observed.RESULTSThe recombinant plasmid was correctly constructed. The hnRNP K was mainly distributed in the nucleus. The intracellular fluorescent aggregates increased with the prolonging stimulation of NaAsO2in the cells transfected with the recombinant plasmid, and the overexpression of hnRNP K inhibited ROS generation in the cells induced by NaAsO2. SP600125, an inhibitor of JNK signaling pathway, significantly inhibited the formation of protein aggregates.CONCLUSIONThe hnRNP K is primarily located in the nucleus of NIH3T3 cells, with a small amount in the cytoplasm. The formation of protein aggregates is significant after NaAsO2stimulation, which can restrain the level of intracellular ROS, and the process is involved in JNK signaling pathway.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K; Sodium arsenite; Aggregates; JNK signaling pathway

Q256

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.020

1000- 4718(2013)06- 1070- 06

2013- 03- 25

2013- 05- 14

國家自然科學基金重點資助項目(No.81030055)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 10251051501000003)；教育部長江學者和創新團隊發展計劃(No.IRT0731)

△通訊作者 Tel: 020-61648231; E-mail: jiang48231@163.com

▲并列第1作者