甲基硒酸對人三陰性乳腺癌細胞化療增敏作用的機制探討*

邱萬壽， 唐 勇， 劉 威， 吳玨堃， 李 璽

(1中山大學附屬第三醫院乳腺疾病診治中心，廣東 廣州 510630； 2長沙市中心醫院普外科，湖南 長沙 410004)

甲基硒酸對人三陰性乳腺癌細胞化療增敏作用的機制探討*

邱萬壽1△， 唐 勇2， 劉 威1， 吳玨堃1， 李 璽1

(1中山大學附屬第三醫院乳腺疾病診治中心，廣東 廣州 510630；2長沙市中心醫院普外科，湖南 長沙 410004)

目的觀察甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)對人三陰性乳腺癌細胞的化療增敏作用及其機制。方法采用MSA聯合紫杉醇、阿霉素與三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株共培養，分別應用CCK-8實驗檢測化療藥物單藥和聯合MSA用藥時細胞增殖抑制率，并通過計算合用指數，探討MSA對化療藥物療效的影響；用流式細胞術檢測細胞周期的分布情況；應用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡變化。結果不同濃度化療藥物聯合MSA后細胞增殖率較單用化療藥物組均下降，呈明顯的量-效關系，提示MSA與化療藥物具協同作用；紫杉醇聯合MSA時G2/M期細胞較單藥明顯增多(P<0.05)，阿霉素聯合MSA時S期細胞較單藥明顯增多(P<0.05)，提示MSA增強了抗腫瘤藥物誘導的腫瘤細胞周期阻滯效應；與單用同一濃度的同一化療藥物相比，10 nmol/L紫杉醇聯合3.5 μmol/L MSA后細胞凋亡率由41.1%上升至59.3%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯合3.5 μmol/L MSA后細胞凋亡率由30.2%上升至51.9%(P<0.01)，提示MSA增強了抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞凋亡的效應。結論MSA能增強化療藥物阿霉素和紫杉醇對三陰乳腺癌細胞的抗腫瘤效果，其機制之一可能是增強了抗腫瘤藥物誘導的腫瘤細胞凋亡和周期阻滯效應。

甲基硒酸； 三陰性乳腺癌； 化療增敏； 細胞周期阻滯； 細胞凋亡

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一類侵襲性強，容易復發、轉移、預后較差的高危乳腺癌。由于其缺乏雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表達，因而不能從內分泌治療和分子靶向治療中獲益。而化療成為TNBC患者術后最重要和有效的治療方式，如何提高化療效果是我們醫生努力的方向之一。有研究[1-2]證實含硒化合物對人TNBC細胞和MCF-7細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。同時研究顯示甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)是具有抗腫瘤作用的含硒小分子化合物，在前列腺癌中能增強某種特定化療藥物的化療療效，具有明顯的化療增敏作用[3]。本研究初步探討MSA對三陰乳腺癌細胞的化療增敏作用，并分析其可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

三陰性乳腺癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心的MDA-MB-231細胞株復蘇、傳代。MSA由暨南大學生命科學學院化學系陳填烽教授惠贈。

2方法

2.1分組 分為無藥物處理組、MSA處理組、紫杉醇處理組、阿霉素處理組、紫杉醇聯合MSA組和阿霉素聯合MSA組。MSA濃度分別為2.5、3.5和4.0 μmol/L，紫杉醇濃度分別為10、20和40 nmol/L，阿霉素濃度分別為0.5、1.0和2.0 μmol/L。

2.2細胞增殖與毒性的檢測 將100 μL MDA-MB-231細胞按5×107/L接種于96孔板后在恒溫37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。細胞貼壁后分別向每孔中添加實驗設計濃度的MSA、紫杉醇及阿霉素，每個濃度設3個復孔，無藥物處理組和空白對照組加PBS，將加藥的細胞置入培養箱。培養24 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，再將培養板放入培養箱孵育1 h。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(A)，各組的A值取均數±標準差用于計算增殖及抑制率。細胞增殖率(%)=(空白組A值-藥物處理組A值/空白組A值-無藥物處理組A值)×100%，細胞抑制率(%)=1-細胞增殖率。

2.3細胞周期的檢測 分別向培養皿中添加實驗設計濃度的MSA、紫杉醇及阿霉素，無藥物處理組加PBS，將加藥的細胞置入培養箱。培養24 h后采用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，去培養基后用預冷的PBS洗滌細胞。洗滌后將細胞再次1 000 r/min離心5 min，去PBS后用預冷的70%無水乙醇重懸細胞，4 ℃固定2 h。再次離心去除固定液，預冷的PBS重懸細胞，并調整細胞濃度為1.0×109/L。加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)工作液，4 ℃避光反應30 min。流式細胞術檢測細胞周期。

2.4細胞凋亡的檢測 將各組細胞共培養24 h后采用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，去培養基后用預冷的PBS洗滌細胞，重復2次。加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。將細胞輕吹打混勻，室溫下避光孵育15 min。流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

3統計學處理

采用SPSS 17.0 統計學軟件處理，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1MSA增強了化療藥物對細胞增殖抑制作用

不同濃度化療藥物聯合MSA后細胞增殖率較單用化療藥物組均下降，見表1、2。當MSA濃度為3.5 μmol/L時作用更加顯著。10 nmol/L紫杉醇單藥應用時增殖率為47.8%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到35.2%，20 nmol/L紫杉醇單藥應用時增殖率為42.3%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到30.4%，40 nmol/L紫杉醇單藥應用時增殖率為38.7%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到28.7%，藥物濃度增加，增殖抑制作用也越強。0.5 μmol/L阿霉素單藥應用時增殖率為54.6%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到46.3%，1 μmol/L阿霉素單藥應用時增殖率為49.3%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到40.6%，2 μmol/L阿霉素單藥應用時增殖率為43.7%，聯合3.5 μmol/L MSA后增殖率下降到36.2%，同時我們還比較了不同濃度的化療藥物在加用MSA和單用時的細胞增殖抑制率，結果顯示聯合MSA后化療藥物的作用明顯增強(P<0.05)。

表1紫杉醇單藥及聯合MSA對TNBC細胞活力的影響

Table 1. Effects of paclitaxel or/and MSA on TNBC cell prolife-ration activity(%.Mean±SD.n=4)

Paclitaxel(nmol/L)MSA(μmol/L)02.53.54010090.3±11.277.6±8.762.4±8.11047.8±5.744.6±2.935.2±2.229.5±1.72042.3±2.836.1±2.330.4±1.726.1±3.84038.7±2.137.6±3.428.7±0.824.4±1.6

表2阿霉素單藥及聯合MSA對TNBC細胞活力的影響

Table 2. Effects of doxorubicin or/and MSA on TNBC cell proli-feration activity(%.Mean±SD.n=4)

Doxorubicin(μmol/L)MSA(μmol/L)02.53.54010090.3±11.277.6±8.762.4±8.10.554.6±6.350.1±5.946.3±3.241.2±3.71.049.3±5.145.4±3.340.6±4.137.3±3.92.043.7±4.139.5±4.436.2±2.932.4±4.2

為了判斷MSA與化療藥物聯合應用是否存在協同作用，我們利用Origin 8.6軟件對各藥物不同濃度抑制率作線性擬合，根據某種藥物產生x的效應可以求得藥物濃度Dx1及Dx2，再根據中效原理計算兩藥聯用的合用指數(combination index，CI)。CI=D1/Dx1+D2/Dx2+D1·D2/Dx1·Dx2，D1、D2為合用時產生x效應時兩藥各自所需的濃度(即實驗設計的藥物濃度)，Dx1、Dx2為兩藥單用時產生x效應時各自的濃度。CI值以1為界值，CI大于1表示兩藥存在拮抗，等于1表示相加，小于1表示有協同作用。結果顯示MSA與阿霉素和紫杉醇聯合應用均存在協同作用,見表3、4。

表3 紫杉醇聯合MSA的合用指數

表4阿霉素聯合MSA的合用指數

Table 4. Combination index of doxorubicin in combination with MSA

Doxorubicin(μmol/L)MSA(μmol/L)2.53.54.00.50.9760.7830.8171.00.8240.7970.8092.00.7680.7440.797

2MSA增強了抗腫瘤藥物誘導細胞周期阻滯

如圖1所示，單用3.5 μmol/L MSA時，細胞周期并沒有明顯變化，S期細胞稍有增加；10 nmol/L紫杉醇組與對照組比較，G0/G1期及S期細胞減少，G2/M期細胞由17%增至42%(P<0.01)，10 nmol/L紫杉醇聯合3.5 μmol/L MSA組與10 nmol/L紫杉醇組比較，G2/M期細胞由42%增至57%(P<0.05)；0.5 μmol/L阿霉素組與對照組比較，S期細胞由26%增至37%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯合3.5 μmol/L MSA組與0.5 μmol/L阿霉素組比較，S期細胞由37%增加到47%(P<0.05)。

Figure 1. Effects of paclitaxel, doxorubicin and paclitaxel (T) or doxorubicin (A) in combination with MSA (M) on the cell cycle distribution of TNBC cells.

圖1紫杉醇、阿霉素及紫杉醇與阿霉素聯合MSA對細胞周期分布的影響

3甲基硒酸增強了抗腫瘤藥物誘導的腫瘤細胞凋亡

MSA、紫杉醇及阿霉素對TNBC細胞均有誘導凋亡作用，MSA聯合化療藥物組的凋亡率較單藥組明顯增加。10 nmol/L紫杉醇聯合3.5 μmol/L MSA后細胞凋亡率由41.1%上升至59.3%(P<0.05)，0.5 μmol/L阿霉素聯合3.5 μmol/L MSA后細胞凋亡率由30.2%上升至51.9%(P<0.01)。

討 論

TNBC是一類缺乏ER/PR/HER2表達的高危類型乳腺癌，具有獨特的臨床病理學特點，腫瘤侵襲性強，生長迅速，瘤體較大，病理分型差，組織學分級高，易復發，軟組織和內臟轉移發生率較高，骨轉移發生率相對較低，預后較差[4-5]。TNBC患者約占乳腺癌人群的12%～24%[6]。與非三陰性乳腺癌患者相比，由于缺乏激素受體及HER2表達，TNBC缺少內分泌治療及分子靶向治療，術后輔助化療是主要的治療手段[7]。雖然大部分TNBC對化療較為敏感，但化療藥物的毒副作用限制其長期應用。有研究表明在復發、轉移性乳腺癌中，希羅達等低毒高效藥物的維持化療能夠使TNBC患者獲益[8]。因此，小劑量維持化療可望為TNBC患者帶來臨床獲益。

在確保化療療效的前提下，如何降低化療藥物的劑量，從而實現減少化療藥物的毒副反應是我們需要解決的問題。化療增敏是其中一種可行的方法，其能夠在保證化療療效的前提下降低化療藥物的劑量和化療不良反應，令維持化療成為可能。此外，增敏化療不僅能夠增強化療藥物的療效，而且可以減少因腫瘤細胞逃避化療而誘導繼發性耐藥的發生。

MSA是第2代有機硒小分子化合物，它對人體正常細胞影響很小，卻能高效地、選擇性地抑制多種腫瘤細胞的增殖[9]。在前列腺癌的研究中發現MSA不但具有抗腫瘤作用，聯合MSA和化療藥物還能夠提高化療藥物對前列腺癌的殺傷作用，表現出明顯的化療增敏作用。由于其抗腫瘤作用機制與傳統化療藥物不盡相同，聯合MSA與傳統化療藥物可能存在協同作用，有望成為化療藥物的增敏劑。

本研究結果顯示MSA聯合紫杉醇和阿霉素共同作用于TNBC細胞，聯合用藥組的細胞增殖抑制率、死亡率均高于化療藥物單藥組。通過計算聯合藥物CI值，我們發現MSA與上述2種化療藥物聯合應用存在協同作用。同時，在比較了小劑量化療藥物聯合MSA和大劑量化療藥物單藥對MDA-MB-231細胞的作用后，我們發現MSA聯合小劑量的化療藥物效應基本接近甚至超過了單用大劑量化療藥物的作用，結果提示MSA能夠增強化療藥物的效果，即MSA聯合化療藥物能夠在保證療效的基礎上降低化療藥物劑量，達到化療增敏的效果。

大部分抗腫瘤藥物都有細胞周期阻滯作用，無論是S期還是G2/M期阻滯都使細胞在增殖分裂過程中易受到藥物干擾，導致分裂過程停滯。我們的實驗結果發現紫杉醇聯合MSA后使更多的腫瘤細胞進入G2/M期，而G2/M期是紫杉醇抗腫瘤作用的敏感周期，從而易化了紫杉醇結合微管蛋白過程，阻礙紡錘絲形成，導致細胞死亡[10]，最終達到了增敏化療的效果。

另外，本研究通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示紫杉醇、阿霉素及MSA對TNBC細胞均有誘導凋亡作用，MSA聯合化療藥物組的凋亡率較單藥組及對照組均明顯增加。提示誘導細胞凋亡是MSA化療增敏的可能機制之一。

本研究證實了甲基硒酸能增強阿霉素、紫杉醇化療藥物對三陰乳腺癌細胞的抗腫瘤作用，誘導腫瘤細胞周期阻滯效應是其化療增敏可能機制之一。聯合MSA與化療藥物可望成為TNBC后續治療新的選擇。

[1] 邱萬壽，郝俊文，李 璽，等. 硒代胱氨酸對人三陰性乳腺癌細胞的抑制作用[J].中華實驗外科雜志，2012，29(10):1983-1985.

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Sensitizationofchemotherapyforhumantriple-negativebreastcancercellsbymethylseleninicacid

QIU Wan-shou1, TANG Yong2, LIU Wei1, WU Jue-kun1, LI Xi1

(1BreastDiseaseCenter,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofGeneralSurgery,ChangshaCentralHospital,Changsha410004,China.E-mail:wsqiu-d@163.com)

AIM: To observe the chemosensitization effect of methylseleninic acid (MSA) on human triple-negative breast cancer (TNBC) cells.METHODSMDA-MB-231 cell line was co-cultured with MSA plus paclitaxel or doxorubicin. The inhibitory rate of cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The combination index was calculated to explore the impact of MSA on the efficacy of chemotherapeutic drugs. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. Annexin V-FITC/PI double staining was applied to detect the cell apoptosis.RESULTSCompared with single usage of chemotherapeutic drugs, the cell proliferation rates were decreased when the chemotherapeutic drugs was combined with MSA, suggesting that there is a synergistic relationship between MSA and chemotherapeutic drugs. Compared with the single-agent groups, the G2/M-phase cells in paclitaxel combined with MSA group increased significantly (P<0.05),and the S-phase cells increased significantly in doxorubicin combined with MSA group (P<0.05). These suggested that MSA enhanced the anticancer effect of the drugs by inducing cell cycle arrest. Compared with single usage of 10 nmol/L paclitaxel, the apoptotic rate increased from 41.1% to 59.3% (P<0.05) as 10 nmol/L paclitaxel combined with 3.5 μmol/L MSA was used. Compared with single usage of 0.5 μmol/L doxorubicin, the apoptotic rate increased from 30.2% to 51.9% (P<0.01) as 0.5 μmol/L doxorubicin combined with 3.5 μmol/L MSA was used. These suggested that MSA enhanced antitumor effect of the drugs by inducing tumor cell apoptosis.CONCLUSIONMSA enhances the antitumor effects of chemotherapeutic drugs doxorubicin and paclitaxel on TNBC cells. One of the possible mechanisms is the enhancement of inducing tumor cell apoptosis and cell cycle arrest.

Methylseleninic acid; Triple-negative breast cancer; Chemosensitization; Cell cycle arrest; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.013

1000- 4718(2013)11- 1990- 04

2013- 08- 06

2013- 10- 08

廣東省科技計劃(No.2008B030301128)

△通訊作者 Tel: 020-85252154; E-mail： wsqiu-d@163.com