1,25-二羥維生素D3負性調控被動致敏人氣道平滑肌細胞中的NF-κB信號通路*

宋穎芳， 賴國祥， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區福州總醫院呼吸與危重癥醫學科，福建 福州 350025)

1,25-二羥維生素D3負性調控被動致敏人氣道平滑肌細胞中的NF-κB信號通路*

宋穎芳， 賴國祥△， 柳德靈， 林慶安， 廖云海

(南京軍區福州總醫院呼吸與危重癥醫學科，福建 福州 350025)

目的探討1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]對被動致敏人氣道平滑肌細胞(HASMCs)中核因子κB(NF-κB)信號通路的影響。方法原代培養HASMCs并使之被動致敏，以1,25-(OH)2D3作為干預因素。EMSA法檢測NF-κB的DNA結合活性；免疫細胞化學染色技術觀察NF-κB p65的核易位情況；Western blotting法檢測核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表達水平；實時熒光定量PCR檢測維生素D受體(VDR)、維生素D 24-羥化酶(CYP24)和IκBα mRNA的表達水平；放線菌素D處理實驗檢測IκBα mRNA的表達。結果(1) 1,25-(OH)2D3顯著削弱被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結合活性及其亞單位 p65的核易位；(2) 1,25-(OH)2D3能通過增加被動致敏HASMCs中IκBα的mRNA穩定性及減少其蛋白磷酸化水平2個途徑顯著上調細胞中IκBα的表達；(3) 1,25-(OH)2D3顯著上調被動致敏HASMCs中VDR的mRNA表達并誘發其功能性反應。結論1,25-(OH)2D3能通過上調被動致敏HASMCs中IκBα的表達抑制細胞NF-κB信號通路，且這一作用與VDR有關，這可能是其調控被動致敏HASMCs的重要作用機制。

哮喘； 氣道平滑肌細胞； 1,25-二羥維生素D3； 核因子κB； 受體,維生素D

氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的表型改變是支氣管哮喘(簡稱哮喘)氣道重塑的結構基礎。核因子κB (nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有多向調節作用的核轉錄因子，近年來被證實是調控ASMCs細胞表型改變的關鍵性調控因子[1]。1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2D3]是體內維生素D(vitamin D, Vit D)最重要的活性代謝產物。本課題組前期研究首次發現1,25-(OH)2D3能抑制人氣道平滑肌細胞(human airway smooth muscle cells，HASMCs)的表型改變[2]。但這種調節作用的具體機制尚不明確。本研究探討1,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中NF-κB信號通路的影響，旨在明確其調節被動致敏HASMCs的可能作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

HASMCs (ScienCell)；放線菌素D(Sigma)；DMEM液(Gibco)； SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；抗NF-κB p65、抗IκBα、抗p-IκBα抗體及ECL發光試劑盒(Santa Cruz)，NE-PERTM試劑盒(Pierce)，Gel Shift Assay Systems試劑盒(Promega)，FastStart SYBR GreenⅠ試劑盒(Roche)。

2HASMCs的培養及分組

HASMCs予以含10%胎牛血清的高糖DMEM液在5%CO2、37 ℃孵箱內進行細胞培養，實驗用4～8代細胞。參照文獻[3]予以制備對照血清及哮喘血清。按隨機排列表法將細胞分成3組：(1)對照組：無血清DMEM液同步化48 h后，用10%對照血清處理HASMCs；(2)哮喘組：無血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs；(3) Vit D組：用含10-7mol/L 1,25-(OH)2D3的無血清DMEM液同步化48 h后，用10%哮喘血清處理HASMCs。各組均于血清刺激1 h后進行以下實驗。

3電泳遷移率變動分析(electrophreticmobilityshiftassay,EMSA)法檢測各組HASMCs中的NF-κB活性

使用NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs的核蛋白，按Gel Shift Assay Systems試劑盒提供的說明書標記NF-κB寡核苷酸探針(5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’；3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’)，并進行DNA結合反應，隨后行5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后干膠，置于-70 ℃放射自顯影；圖像分析軟件測量各樣品電泳滯后帶的相對吸光度(A)。

4免疫細胞化學法檢測各組HASMCs中NF-κBp65核移位情況

甲醛固定細胞，用1∶1 000稀釋羊抗人NF-κB p65抗體作為Ⅰ抗，按SABC試劑盒說明進行SABC法染色，以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。NF-κB p65的陽性表達呈棕黃色顆粒，可位于細胞質和細胞核。顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野，計數胞核陽性表達細胞數并計算胞核陽性率。

5Westernblotting法檢測各組HASMC中的IκBα和p-IκBα的表達

NE-PERTM試劑盒提取HAMSCs總蛋白，10% SDS-PAGE分離樣品細胞總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜，用1∶1 000稀釋的抗IκBα和p-IκBα抗體分別進行蛋白印記分析，用ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統確定各蛋白條帶的相對灰度值。

6實時熒光定量PCR檢測各組HASMCs中維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)、維生素D24-羥化酶(vitaminD24-hydroxylase,CYP24)和IκBαmRNA的表達

Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA后取2 μL cDNA作為反應模板進行PCR擴增。各目的基因引物見表1。PCR反應條件：VDR：95 ℃ 20 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，38個循環；CYP24：95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環；IκBα：95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環；GAPDH：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環。反應結束后，儀器自動記錄每個樣品管中的熒光強度增加到熒光閾值所對應的擴增循環數(Ct)。以GAPDH為內參照，計算目的基因mRNA的相對含量[目的基因mRNA/GAPDH mRNA=2-ΔCt(ΔCt =Cttarget-CtGAPDH)]。每組設3個復孔。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

7放線菌素D處理實驗測定各組HASMCs中IκBαmRNA的表達

給予10 mg/L的放線菌素D處理細胞，以終止基因轉錄。分別于作用0、1、2、3、4、5和6 h后提取細胞RNA并采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞IκBα mRNA的表達。

8統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS 16.0軟件進行One-way ANOVA檢驗和SNK-q檢驗進行兩兩間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

11,25-(OH)2D3對NF-κBDNA結合活性的影響

與對照組相比，哮喘組HASMCs中NF-κB的DNA結合活性明顯升高，其電泳滯后帶的相對A值是對照組的(7.78±0.53)倍(P<0.05)；而1,25-(OH)2D3顯著抑制了被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結合活性，其電泳滯后帶的相對A值僅是對照組的(5.18±0.31)倍，與哮喘組比較差異顯著(P<0.05)，見圖1。

21,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中NF-κBp65核移位的影響

Figure 1. Inhibition of NF-κB DNA-binding activity in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3.1: non-specific competition; 2: specific competition; 3: control group; 4: asthma group; 5: Vit D group.

圖11,25-(OH)2D3抑制被動致敏HASMCs中NF-κBDNA結合活性

對照組細胞中可見NF-κB p65陽性產物棕黃色顆粒，主要分布在細胞質中，其胞核陽性率為(13.24±3.58)%；哮喘組陽性表達顆粒明顯增加，且在胞核內明顯增加，其胞核陽性率較對照組明顯增高，為(42.76±4.79)% (P<0.05)；而Vit D組陽性表達顆粒核內增加不明顯，較為均勻地分布于胞質及胞核中，其胞核陽性率為(25.58±5.43)%，較哮喘組有所下降(P<0.05)，但仍高于對照組,見圖2。

Figure 2. Inhibition of nuclear translocation of NF-κB p65 in passively sensitized HASMCs by 1,25-(OH)2D3(DAB,×400).A: control group; B: asthma group; C: Vit D group.

圖21,25-(OH)2D3抑制被動致敏HASMCs中NF-κBp65的核移位

31,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs中IκBα蛋白表達水平的影響

Vit D組IκBα蛋白表達量(0.27±0.04)較哮喘組(0.15±0.03)明顯增高，但兩者均低于對照組(0.42±0.05)(P<0.05)，即1,25-(OH)2D3能上調哮喘狀態下HASMCs中IκBα的蛋白表達,見圖3。

Figure 3. 1,25-(OH)2D3increased IκBα protein expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsasthma group.

圖31,25-(OH)2D3增加被動致敏HASMCs中IκBα蛋白的表達

41,25-(OH)2D3對IκBαmRNA表達的影響

哮喘血清中IκBα的mRNA 半衰期為(192.91±8.33)min，而Vit D的預處理可使其半衰期延長至(264.13±10.76)min。由此可見1,25-(OH)2D3能顯著增強細胞中IκBα mRNA的表達水平，這是1,25-(OH)2D3上調IκBα蛋白表達的主要原因,見圖4。

Figure 4. 1,25-(OH)2D3IκBα mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.

圖41,25-(OH)2D3增加被動致敏HASMCs中IκBαmRNA的表達

51,25-(OH)2D3對被動致敏HASMCs總蛋白中p-IκBα表達水平的影響

IκBα蛋白的降解是影響IκBα蛋白表達的另一重要原因。而磷酸化是IκBα蛋白降解的先決條件。圖3顯示，1,25-(OH)2D3能抑制哮喘肺組織中p-IκBα的蛋白表達。為排除IκBα的表達水平對p-IκBα表達的影響，實驗用IκBα蛋白表達量對p-IκBα蛋白表達量進行標化，結果發現Vit D組p-IκBα/IκBα為0.41±0.05，亦顯著低于哮喘組的0.86±0.04 (P<0.05)，但仍高于對照組的0.17±0.03 (P<0.05)。由此可見1,25-(OH)2D3能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制其蛋白降解，這是1,25-(OH)2D3上調IκBα蛋白表達的另一重要原因。

6各組細胞中VDR及CYP24mRNA的表達

哮喘組及對照組僅有極低水平的VDR及CYP24 mRNA表達，且2組之間差異無統計學意義(P>0.05)；而1,25-(OH)2D3明顯上調了這2個目的基因的mRNA表達水平(P<0.01)，見圖5。這一結果不僅證實了VDR在HASMCs中的表達，而且還說明1,25-(OH)2D3能有效上調HASMCs中VDR的表達并誘發其功能性反應。

Figure 5. 1,25-(OH)2D3increased VDR (A) and CYP24 (B) mRNA expression in passively sensitized HASMCs.Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsasthma group.

圖5各組HASMCs中VDR及CYP24mRNA的水平

討 論

1,25-(OH)2D3主要通過與VDR的結合產生生物學效應。隨著VDR被明確為哮喘的易感基因，1,25-(OH)2D3對哮喘的調節作用受到越來越廣泛的關注[4]。ASMCs的細胞表型改變是哮喘氣道重塑的結構基礎，目前已成為哮喘氣道重塑研究及治療的重要標靶。本課題組的前期研究首次發現1,25-(OH)2D3能抑制哮喘狀態下HASMCs的高增殖狀態并抑制其表達基質金屬蛋白酶9，從細胞水平初步揭示了1,25-(OH)2D3調節哮喘氣道重塑的能力[2]。Damera等[5]亦證實1,25-(OH)2D3能抑制血小板源性生長因子誘導的HASMCs增殖，并指出這種抑制作用是通過1,25-(OH)2D3對細胞檢測點激酶1和Rb蛋白的磷酸化來實現。但這種作用機制并不足以解釋1,25-(OH)2D3對HASMCs表達MMP-9的抑制作用，因此1,25-(OH)2D3勢必存在其它信號通路來同時調控HASMCs的增殖和MMP-9的表達。

NF-κB信號通路是哮喘發病機制中最受關注的信號轉導系統之一，其在哮喘患者氣道中被過度活化[6]。現已明確，NF-κB的活化須具備2個條件：(1)與IκB的解離；(2) NF-κB的核移位。故判斷NF-κB的活性水平時應強調以下2點：NF-κB的核移位和IκB的降解水平。

本研究不僅用經典的EMSA法證實1,25-(OH)2D3能顯著抑制被動致敏HASMCs中NF-κB的DNA結合活性，而且還用免疫細胞化學染色法直觀地證實1,25-(OH)2D3能有效地抑制細胞中NF-κB的核移位。IκB是NF-κB的主要抑制蛋白, 在已知的IκB家族成員中，IκBα與NF-κB活化關系最為密切，其含量的變化能間接反應NF-κB的活化程度。本研究亦證實1,25-(OH)2D3能通過增加被動致敏HASMCs中IκBα mRNA的表達及減少其磷酸化水平而顯著上調細胞中IκBα的表達，即抑制IκBα的降解。上述結果說明1,25-(OH)2D3具有抑制被動致敏HASMCs中NF-κB活化的能力。

鑒于NF-κB是調節哮喘狀態下ASMCs功能的關鍵轉錄因子，有理由認為1,25-(OH)2D3對HASMCs中NF-κB活化的這種抑制作用在其調節HASMCs的功能中扮演著重要的角色，這不僅為拓展1,25-(OH)2D3在哮喘治療中的臨床應用提供了最基礎的理論依據；而且還為臨床治療哮喘(尤其是難治性哮喘)、慢性阻塞性肺疾病等ASMCs過度增殖性疾病開辟了新的研究平臺。

業已證實，1,25-(OH)2D3的生物學效應與靶組織中的VDR含量直接相關，它可通過增強VDR蛋白的穩定性等多種方式上調VDR的表達[7]。而VDR是NF-κB活性調控中的重要上游分子：VDR不僅能直接上調IκBα的表達并增強IκBα的穩定性[8]，而且還與NF-κB的亞單位 p65存在生理性結合，通過直接阻礙p65的核易位及其與DNA的結合活性等方式來直接抑制NF-κB p65的活性[9]。迄今為止，已發現在胚胎成纖維細胞、單核細胞、內皮細胞及樹突細胞等多種細胞中，1,25-(OH)2D3正是借由與VDR的受體配體效應來調節NF-κB信號通路進而細胞特異性地調節它們的生物學功能[10-11]。有意思的是，本研究結果亦發現VDR存在于HASMCs上，且1,25-(OH)2D3能顯著上調被動致敏HASMCs中VDR的mRNA水平并誘發其功能性反應，結合本實驗中1,25-(OH)2D3調節NF-κB活性研究的相關結果，推測1,25-(OH)2D3對HASMCs中NF-κB的抑制作用可能也是VDR依賴性的，后續的實驗將對這一可能作用機制進行深入研究。

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1,25-dihydroxyvitaminD3inhibitsnuclearfactorkappaBsignalingpathwayinpassivelysensitizedhumanairwaysmoothmusclecells

SONG Ying-fang, LAI Guo-xiang, LIU De-ling, LIN Qing-an, LIAO Yun-hai

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou350025,China.E-mail:laiguoxiang2007@163.com)

AIM: To investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25-(OH)2D3] on nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway in passively sensitized human airway smooth muscle cells (HASMCs).METHODSHASMCs were passively sensitized with 10% serum from asthmatic patients. 1,25-(OH)2D3was used as an interfering factor. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect the DNA-binding activity of NF-κB. Immunocytochemical staining was used to observe the nuclear translocation of NF-κB p65. Western blotting was used for IκBα and phosphorylated IκBα protein detection. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine vitamin D receptor (VDR), vitamin D 24-hydroxylase (CYP24) and IκBα mRNA expression. The mRNA expression of IκBα in HASMCs after actinomycin D treatment was also determined.RESULTS(1) 1,25-(OH)2D3significantly attenuated the DNA-binding activity of NF-κB and the nuclear translocation of NF-κB p65 in HASMCs passively sensitized by asthmatic serum. (2) 1,25-(OH)2D3enhanced IκBα mRNA stability and inhibited IκBα protein phosphorylation in passively sensitized HASMCs, thus increasing IκBα expression in these HASMCs. (3) 1,25-(OH)2D3up-regulated VDR mRNA level and evoked its functional response in passively sensitized HASMCs.CONCLUSION1,25-(OH)2D3enhanced the expression of IκBα and therefore inhibited NF-κB signaling passway in HASMCs. This effect may be dependent on VDR, and responsible for the inhibitory effect of 1,25-(OH)2D3on passively sensitized HASMCs.

Asthma; Airway smooth muscle cells; 1,25-Dihydroxyvitamin D3; Nuclear factor kappa B; Receptors, vitamin D

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.023

1000- 4718(2013)11- 2044- 05

2013- 03- 21

2013- 08- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81100011)；福建省自然科學基金資助項目(No. 2011J05087)

△通訊作者 Tel: 0591-22859333； E-mail: laiguoxiang2007@163.com