FHL1在香煙煙霧刺激的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖與遷移中的作用*

蒲桂梅， 楊 莉， 李玉蘋△， 陳成水， 蔣 磊

(溫州醫學院附屬第一醫院 1呼吸內科， 2龍灣內科實驗室，浙江 溫州 325000)

FHL1在香煙煙霧刺激的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖與遷移中的作用*

蒲桂梅1， 楊 莉1， 李玉蘋1△， 陳成水1， 蔣 磊2

(溫州醫學院附屬第一醫院1呼吸內科，2龍灣內科實驗室，浙江 溫州 325000)

目的研究FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1)在香煙煙霧提取物(CSE)刺激的大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖及遷移中的作用。方法原代培養PASMCs，分別予CSE及FHL1 siRNA轉染干預，分為6組：空白組、陰性轉染組、FHL1 siRNA轉染組、CSE組、CSE+陰性轉染組和CSE+FHL1 siRNA轉染組。Real-time PCR法檢測FHL1 mRNA的表達，Western blotting法檢測FHL1 蛋白，CCK-8法檢測細胞增殖，Transwell 法測定細胞遷移。結果CSE刺激導致PASMCs增殖、遷移及FHL1蛋白表達增加 (P<0.01) ，但FHL1 mRNA的表達無明顯改變(P>0.05)。FHL1 siRNA轉染PASMCs，可降低CSE所致的PASMCs增殖及遷移(P<0.01)。結論CSE可促進PASMCs增殖與遷移以及FHL1蛋白的表達， 抑制FHL1蛋白的表達可減弱CSE對PASMCs增殖和遷移的作用。這些結果表明CSE促進PASMCs增殖和遷移與FHL1蛋白有關。

FHL1蛋白； 吸煙； 肺動脈平滑肌細胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)相關的肺動脈高壓不僅由慢性低氧導致的血管收縮所引起，肺血管重塑、心臟并發癥以及肺實質的損傷也都共同參與了肺動脈高壓的形成[1]。香煙煙霧暴露是COPD發生的重要危險因素。近年來，研究發現香煙煙霧暴露可以導致肺血管功能障礙和血管重塑[2-3]，進而與COPD肺動脈高壓的形成密切相關。香煙煙霧暴露的血管重塑主要表現為血管平滑肌細胞的增殖和遷移[2]。

FHL1(four-and-a-half LIM domain 1)存在于多種組織中,與人類特發性肺動脈高壓、動脈夾層、肥厚型心肌病、骨骼肌肌病以及腫瘤的發生發展相關[4-8]。Kwapiszewska等[4]研究發現在低氧和野百合堿所致的肺動脈高壓大鼠中，肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖和遷移增加的同時FHL1蛋白表達增加； 用FHL1 siRNA干預人原代PASMCs，可導致FHL1蛋白表達降低伴PASMCs增殖和遷移減弱；而在FHL1過表達的原代PASMCs中，其增殖和遷移明顯增加。然而，FHL1在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激引起的PASMCs增殖和遷移中會有何作用尚缺乏研究。本文就以此為切入點進行如下研究。

材 料 和 方 法

1動物與材料

清潔級雄性SD大鼠(約200 g)，購自溫州醫學院動物實驗中心，并通過動物實驗倫理審查同意。PBS、膠原酶I、胎牛血清和DMEM液均為Gibco產品。兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體和小鼠抗大鼠FHL1單克隆抗體購自Abcam，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自北京中杉，山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗小鼠Ⅱ抗均購自EarthOx。紅雙喜香煙(含焦油量13 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)由上海卷煙廠生產。陰性siRNA序列(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)和FHL1 siRNA序列(UGCCAAGCAUUGCGUGAAA和CUAAGGAGG UGGACAUAA)由上海吉瑪公司合成。Lipofectamine RNAiMAX和SYBR Green試劑盒購自ABI。FHL1引物(上游5’-GTG CCC TTG TAC TCC ACG TT-3’，下游5’-GTG TCC AAG GAT GGC AAG AT-3’)和內參照GAPDH引物(上游5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’ ， 下游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’)由上海生工生物工程公司合成。細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購自日本同仁公司。Transwell板購自Corning。

2大鼠遠端PASMCs原代培養及鑒定

參照文獻[9]并稍作修改，超凈臺內用纖維器械在PBS中取肺動脈3級以下分支，刮除外膜及內膜，膠原酶I消化法分離PASMCs。將消化的細胞裝入含10%胎牛血清DMEM液的培養瓶，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。通過細胞形態學、α-SMA免疫熒光法及免疫細胞化學法(1∶1 000)鑒定。原代培養至3～6代的PASMCs用于實驗，調整細胞濃度為5×107/L。分別予CSE及FHL1 siRNA轉染干預，分為6組：空白組、陰性轉染組、FHL1 siRNA轉染組、CSE組、CSE+陰性轉染組及CSE+FHL1 siRNA轉染組。

3CSE制備及干預

CSE制備參照文獻[10]并作適當修改。將去除過濾嘴的香煙點燃，負壓吸引香煙煙霧至裝有DMEM液的密閉玻璃瓶中，輕輕搖晃使其溶解，氫氧化鈉溶液調節pH值至7.4，超凈臺內過濾除菌，即為CSE原液。使用時，根據實驗所需不同濃度，用含10%胎牛血清的DMEM液稀釋CSE原液，30 min內用于實驗。

4FHL1siRNA轉染

Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑瞬時轉染FHL1 siRNA至PASMCs，抑制FHL1 mRNA表達。3～6代的原代細胞懸液，每孔0.5 mL接種于24孔板，細胞在無雙抗的培養液中培養24 h后進行轉染。據Lipofectamine RNAiMAX產品說明操作，siRNA和Lipofectamine RNAiMAX用DMEM液稀釋后混合放置15～20 min用于轉染，經再培養48 h后提取細胞總RNA，72 h后提取細胞總蛋白。

5Real-timePCR法檢測FHL1mRNA

體系配制參照SYBR Green試劑盒說明進行，選用GAPDH作為內參照。反應條件設置為：50 ℃ 2 min(1個循環)；95 ℃ 10 min(1個循環)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min(40個循環)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s(1個循環)。數據采用 2-ΔΔCt法進行統計分析。

6Westernblotting法檢測FHL1蛋白

3～6代的原代細胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板，實驗干預后，繼續培養72 h后提取每組總蛋白。經濃度測定及標化后，取每組相同蛋白上樣量經緩沖液稀釋，先后進行電泳和轉膜。轉至PVDF膜上的蛋白，用含5 %脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h，再用小鼠抗大鼠FHL1單克隆抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，內參照選用β-actin(1∶1 000)。次日， TBST溶液洗滌Ⅰ抗后，常溫下山羊抗小鼠Ⅱ抗孵育1 h， TBST溶液洗滌Ⅱ抗后， ECL發光試劑盒發光，暗室顯影定影，條帶掃描后行灰度分析。

7CCK8法檢測細胞增殖

3～6代的原代細胞懸液，每孔0.1 mL接種于96孔板，每組設3個復孔，待長至50%～70%融合時進行干預，后繼續培養24 h，每孔加10 μL CCK-8，置入37 ℃、含5 %CO2的培養箱中培養0.5～2 h，450 nm波長下檢測吸光度(A)。

8Transwell法測定細胞遷移

3～6代的原代細胞懸液，每孔0.5 mL接種于24孔板，干預后繼續培養24 h，胰酶消化，細胞計數，調整細胞濃度為2×108/L，每孔0.1 mL的只含DMEM培養液的細胞懸液轉移到小室中，下室每孔加0.5 mL含10 %胎牛血清的DMEM液。繼續培養24 h后，甲醛固定、結晶紫染色后擦去小室上層細胞，顯微鏡下計數小室下層細胞，每個小室隨機取5個視野計數用于統計分析。

9統計學處理

數據采用SPSS 20.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，進行方差齊性及正態性檢驗。多組間差異的顯著性檢驗采用單因素方差分析，多組內兩兩比較采用LSD檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞鑒定

PASMCs在倒置顯微鏡下觀察形態呈梭形、三角形等,見圖1。PASMCs經免疫細胞化學染色，DAB顯色，有97%的細胞漿中可見與細胞長軸平行的棕黃色肌絲，即α-SMA,見圖2。PASMCs免疫熒光染色，可見胞漿被FITC標記的熒光Ⅱ抗染成綠色，胞核被DAPI染成藍色,見圖3。上述結果證實實驗成功培養PASMCs。

Figure 1. Morphology of rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells(×100).

圖1大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞形態學觀察

Figure 2. α-SMA immunocytochemistry (A,×100； B,×1 000).

圖2α-SMA免疫細胞化學染色

2FHL1siRNA轉染效能檢測

PASMCs經FHL1 siRNA轉染后， FHL1 mRNA表達(5.277±0.918)與陰性轉染組(33.198±10.730)相比差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4A。FHL1 siRNA轉染組較陰性轉染組FHL1蛋白表達明顯降低(P<0.01)，見圖4B。這些結果證實實驗成功進行FHL1 siRNA轉染。

Figure 3. α-SMA immunofluorescence staining of rat pulmonary arterial smooth muscle cells (×400).

圖3大鼠肺動脈平滑肌細胞α-SMA免疫熒光染色

Figure 4. FHL1 mRNA (A) and protein (B) expression in PASMCs afterFHL1 siRNA transfection. 1: blank control group; 2: negative transfection group; 3: FHL1 siRNA transfection group.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs2.

圖4FHL1siRNA轉染后肺動脈平滑肌細胞中FHL1mRNA和蛋白的表達

3CSE對細胞增殖的影響

不同濃度的CSE對細胞進行干預24 h后，CCK-8法檢測細胞增殖，1%、3%、5%、10%和20% CSE組細胞吸光度與0%組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)，其中5%CSE對PASMCs增殖影響最明顯，見圖5。因此本實驗選用5%作為CSE干預PASMCs的濃度。

Figure 5. The proliferation of PASMCs after treatment with different concentrations of CSE. Mean±SD.n=4.**P<0.01vs0% CSE.

圖5不同濃度CSE干預后肺動脈平滑肌細胞的增殖情況

4CSE對細胞FHL1mRNA和蛋白表達及細胞遷移的影響

CSE組FHL1蛋白表達較空白組明顯增加(P<0.01)，見圖6。但CSE組與空白組FHL1 mRNA差異無統計學意義(79.879±8.669和75.636±5.257，P>0.05)。CSE組細胞遷移較空白組明顯增加，見圖7。

Figure 6. FHL1 protein expression in PASMCs in blank control and CSE groups. 1: blank control; 2: CSE group.

圖6空白組與CSE組肺動脈平滑肌細胞中FHL1蛋白的表達

Figure 7. The migration of PASMCs 24 h after CSE intervention (crystal violet staining,×400). A: blank control group; B: CSE group.

圖7CSE干預細胞24h后細胞的遷移

5CSE與FHL1siRNA轉染共同干預對PASMCsFHL1蛋白表達及增殖和遷移的影響

CSE+FHL1 siRNA轉染組FHL1蛋白表達較CSE組及CSE+陰性轉染組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖8。CSE+FHL1 siRNA轉染組細胞增殖及遷移均較CSE組及CSE+陰性轉染組減弱(P<0.01)，見表1。

Figure 8. FHL1 protein expression after CSE stimulation andFHL1 siRNA transfection. 1: blank control group; 2: negative transfection group; 3:FHL1 siRNA transfection group; 4: CSE group; 5: CSE + negative transfection group; 6: CSE +FHL1 siRNA transfection group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs1;##P<0.01vs2;△△P<0.01vs4 or 5.

圖8CSE及FHL1siRNA轉染分別及共同干預后FHL1蛋白的表達

表1各組細胞增殖和遷移結果

Table 1. The proliferation and migration of PASMCs (Mean±SD.n=4)

GroupProliferationMigrationBlankcontrol0.732±0.03323.250±2.986Negativetransfection0.687±0.02823.250±1.708FHL1siRNAtransfection0.547±0.032**##7.250±1.258**##CSE0.950±0.067**35.750±2.062**CSE+negativetransfection0.955±0.079##35.250±2.754##CSE+FHL1siRNAtransfection0.792±0.024△△18.750±3.363△△

**P<0.01vsblank control;##P<0.01vsnegative transfection;△△P<0.01vsCSE or CSE+negative transfection.

討 論

FHL1蛋白是指含有4個半LIM結構域的蛋白質，是FHL蛋白家族的重要成員之一，它主要參與調節基因轉錄、細胞增殖、分化以及凋亡[11]。FHL1基因位于人類染色體Xq27 上，編碼FHL1蛋白[12]。許多疾病通過FHL1基因的突變引起氨基酸殘基結構的改變而影響LIM結構域的穩定性，最終導致疾病的發生發展[7]。早在1994年，就有學者研究發現，含LIM結構域的蛋白在骨骼肌細胞中高表達，并在其生長、分化和遷移中起到非常重要的作用[13]。但是，有關FHL1在血管平滑肌細胞中的作用研究甚少。Weng等[5]在大鼠胸主動脈平滑肌的研究中發現FHL1在人胸主動脈夾層血管平滑肌中表達明顯降低，提示FHL1與血管平滑肌功能相關。而本實驗發現通過FHL1 siRNA轉染，有效減少FHL1 mRNA及FHL1蛋白的表達，可導致PASMCs的增殖和遷移減弱，相似的結果也同樣出現于Kwapiszewska 等[4]在人原代肺動脈平滑肌細胞的研究中，說明FHL1與肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移相關。

香煙煙霧暴露與人類多種疾病的發生發展密切相關。本實驗發現，CSE干預大鼠遠端PASMCs，可導致細胞增殖和遷移能力明顯增加。但是隨著CSE濃度的提高，其對平滑肌細胞的增殖和遷移作用并沒有繼續增加。這與Hu等[14]及Silva等[15]的發現一致。因此，本實驗最終選定5%CSE用于實驗的干預，這與諸多國內外學者在細胞及動物實驗中選用的CSE濃度是一致的。CSE組平滑肌細胞增殖和遷移均較空白組明顯增高。由于肺血管重塑主要表現為血管壁平滑肌細胞的重新排列和增生改變，因此我們認為CSE所導致的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移與肺血管重塑密切相關。

本實驗還發現，CSE導致PASMCs增殖及遷移增加，伴FHL1蛋白增加，提示FHL1蛋白與CSE所致的PASMCs增殖和遷移相關。但本實驗中，CSE刺激并未導致FHL1 mRNA表達增加，究其原因，可能是CSE導致的FHL1蛋白增加的機制不是通過促進FHL1 mRNA表達，而是通過抑制FHL1蛋白的降解。目前相關研究表明，細胞內蛋白降解主要通過2條途徑，即自噬和泛素蛋白酶體系統[16]。后續實驗可通過檢測以上2條途徑中的相關基因來進一步明確CSE導致FHL1蛋白表達增加的機制。

CSE干預初步提示FHL1蛋白與CSE所致PASMCs的增殖及遷移增加有關，因此本實驗進一步行FHL1 siRNA干預，發現CSE+FHL1 siRNA轉染組與CSE+陰性轉染組相比，CSE導致的細胞增殖和遷移作用隨著FHL1表達的抑制而減弱了。這進一步證實CSE促進PASMCs增殖和遷移通過FHL1蛋白起作用。這一結果，也為香煙煙霧暴露所致的肺血管重塑和肺動脈高壓的分子靶向治療提供了研究方向。

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EffectsofFHL1onproliferationandmigrationofratpulmonaryarterialsmoothmusclecellsstimulatedbycigarettesmoke

PU Gui-mei1, YANG Li1, LI Yu-ping1, CHEN Cheng-shui1, JIANG Lei2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,2LongwanMedicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:wzliyp@qq.com)

AIM: To explore the role of four-and-a-half LIM domain 1 (FHL1) in the proliferation and migration of rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) stimulated by cigarette smoke extract (CSE).METHODSRat distal PASMCs were isolated and primarily cultured. The cells were divided into 6 groups: blank control group, negative transfection group,FHL1 siRNA transfection group, CSE group, CSE + negative transfection group and CSE +FHL1 siRNA transfection group. The mRNA and protein expression of FHL1 was detected by real-time PCR and Western blotting, respectively. Cell proliferation and migration were determined by CCK-8 and Transwell assays, respectively.RESULTSCSE promoted the proliferation and migration of PASMCs, and increased the expression of FHL1 protein (P<0.01), but did not change the expression of FHL1 mRNA (P>0.05).FHL1 siRNA transfection attenuated the proliferation and migration of PASMCs induced by CSE (P<0.01).CONCLUSIONFHL1 protein is involved in CSE-induced proliferation and migration of rat PASMCs.

FHL1 protein; Smoking; Pulmonary arterial smooth muscle cells

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.024

1000- 4718(2013)11- 2049- 05

2013- 06- 05

2013- 07- 30

浙江省自然科學基金資助項目(No.LQ13H010002)；溫州市科技計劃資助項目(No.Y20100292)

△ 通訊作者 Tel： 0577-55579276； E-mail： wzliyp@qq.com