赫賽汀聯合順鉑對人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的抑制作用研究

劉靜芳，湯在祥，胡建銘 (.蘇州大學附屬第一醫院婦產科，江蘇 蘇州 5000;.蘇州大學公共衛生學院遺傳流行病與基因組學研究中心，江蘇 蘇州 5000)

卵巢癌(Ovarian Cancer)是發生于女性生殖器官的三大惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科惡性腫瘤之首。傳統的卵巢癌治療由于腫瘤細胞基因的不穩定性導致對各種化療藥物的耐藥性逐漸增強，因此晚期卵巢癌的5年生存率一直徘徊在20%～30%。因此尋找新型治療方法具有非常重要的臨床意義。

赫賽汀是針對HER－2/neu蛋白設計的人源化鼠嵌合型抗體，是一種新型、高效、低毒、選擇性強的靶向治療藥物，1998年被美國FDA批準上市，已通過Ⅲ期臨床試驗，取得了令人鼓舞的療效［1］。在細胞水平上，王家菁等人的研究顯示［2］，赫賽汀能有效抑制腎癌細胞的生長，對瘤細胞的耐藥性也有一定的抑制作用。胡志全等人將赫賽汀與干擾能聯合應用［3］，發現聯合用藥能有效抑制腎癌細胞生長，對瘤細胞的耐藥性具有一定逆轉作用。司馬玲等人的研究表明［4］，赫賽汀聯合姜黃素能夠抑制卵巢癌細胞系SKOV3的增殖，這種抑制作用通過促進腫瘤細胞凋亡而實現。在動物模型上，張宇等人發現赫賽汀對HER2基因高表達胃癌細胞裸鼠移植瘤具有顯著的抑制作用［5］。而柳建軍等人在小鼠上的研究表明，赫賽汀對HER2陽性的實驗性膀胱腫瘤具有抑制生長促進凋亡的作用［6］。在臨床研究上，杜珂等人的研究表明［7］，赫賽汀聯合長春瑞濱治療晚期乳腺癌是有效且安全的治療方案，不良反應可耐受，可作為晚期乳腺癌一線方案應用。王永鳳等人的臨床研究顯示［8］，與赫賽汀單獨應用和常規化療相比，赫賽汀聯合紫杉醇能顯著提高HER22過表達的轉移性乳腺癌的療效，且不增加不良反應。也有研究發現該藥對過表達HER－2/neu蛋白的晚期乳腺癌患者有較好的療效，可明顯延長生存期，與多種化療藥物有良好的協同效應。卵巢癌與乳腺癌相似，HER－2/neu蛋白的過度表達率為10% ～30%［9］。本研究擬將赫賽汀和順鉑聯合應用，以探討聯合用藥對高表達HER－2的人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的腫瘤抑制作用效果。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑:人卵巢癌SKOV3細胞株(蘇州大學免疫實驗室提供);BALB/cA裸小鼠，雌性，5～6周齡，體重(18±2.0)g，由上海斯萊克實驗動物有限公司所提供，合格證編號:SCXK(滬)2007－0005;赫賽汀(Roche，USA);順鉑:山東齊魯制藥廠;RPMI 1640培養基:美國Gibco公司;小牛血清:杭州四季青公司;鼠抗人Ki－67單克隆抗體:美國Santa Cruz公司;鼠抗人NF－kB p65單克隆抗體:美國Santa Cruz公司;細胞凋亡原位檢測(TUNEL)試劑盒:德國Roche公司。

1.2 細胞培養:細胞用RPMI 1640培養液加10%優質胎牛血清，于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，24～48 h換液1次，當細胞的覆蓋率達到70% ～80%時傳代。每天在高倍顯微鏡下觀察細胞生長情況，最后取對數生長期的細胞用于細胞接種。

1.3 動物接種:將傳代培養處于對數生長期的人卵巢癌SKOV3細胞制備成細胞懸液后在細胞記數板上作細胞記數，調整形成活細胞濃度為4×107/ml的細胞懸液;在無菌條件下，將該細胞懸液接種于裸小鼠右側背部皮下。于接種14天左右，小鼠右側背部可見長出大小較為一致的瘤體，即為動物腫瘤模型建造成功。

1.4 動物分組及給藥方案:將成瘤裸鼠隨機分成五組:①生理鹽水組(陰性對照組);②赫賽汀低劑量組;③赫賽汀高劑量組;④順鉑組;⑤赫賽汀高劑量與順鉑聯合組。每組為15只裸鼠，在普通無菌室的超凈生物層流架中分籠飼養。給藥劑量參考前人和本課題組前期的研究，分別確定為:赫賽汀低劑量組20 mg/kg，赫賽汀高劑量組40 mg/kg，順鉑劑量5 mg/kg，陰性對照組給予等體積量生理鹽水。各組均為尾靜脈注射給藥，每周1次，連續給藥6周。其后觀察各組的抑瘤率、生存期。抑瘤率(%)=(對照組瘤體積―實驗組瘤體積)/對照組瘤體積×100%。

1.5 免疫組化實驗:取各組腫瘤組織給予病理學檢查及免疫組化染色。Envision二步法:60℃烤片30分鐘后二甲苯脫蠟10 min，2次，梯度濃度乙醇(100%，95%，80%，70%)各5 min，蒸餾水洗5 min，2次，放入抗原修復液內微波修復10 min，PBS液洗3次，將切片在0.3%過氧化氫－甲醇溶液中室溫下孵育30 min，再用PBS液洗3次，將切片置于濕盒中，滴入一抗，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS液洗3次，滴入Envision溶液，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS液洗3次;DAB顯色15 min;水洗，蘇木精淡染，藍化，脫水，透明，封固。

1.6 結果判斷:Ki－67以細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞;NF－kB p65以胞核和(或)胞質出現黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。Ki－67、NF－kBp65的染色結果均以標記指數(labeling index，LI)記錄，方法是任意選取10個400倍視野，計數1000個腫瘤細胞中的陽性細胞數，計算LI=(陽性細胞數/1000)×100。

1.7 統計學處理:采用SPSS17.0統計軟件對數據進行處理，數據采用均數±標準差()表示，組間差異采用方差分析方法進行分析。

2 結果

在開始用藥當天，各組裸鼠移植瘤的體積無差異(P＞0.05)。由表1內數據可見，陰性對照組裸鼠瘤體體積增大較快，在14 d后陰性對照組瘤體體積顯著大于四個實驗組瘤體體積(P＜0.01);其次是赫賽汀低劑量組，在各個時間點的增長速度也較快。然而，赫賽汀高劑量組和順鉑組在后期均有不同程度的降低，赫賽汀高劑量聯合順鉑組腫瘤體積降低最快，在各個時間點與其他組具有顯著差異，表明赫賽汀高劑量聯合順鉑可有效降低腫瘤體積。在抑瘤率方面，表2結果顯示:各組的抑瘤率均有不同程度上升，但在28 d后，赫賽汀高劑量聯合順鉑組抑瘤率顯著高于其他各組。值得一提的是，28 d后，赫賽汀高劑量組和順鉑組的抑瘤率差異沒有統計學意義(P＞0.05)。赫賽汀低劑量組的抑瘤率在各個時間點均最低，表明赫賽汀高劑量聯合順鉑能有效抑制腫瘤發展。

表1 各組用藥后不同時間腫瘤體積變化(，mm3)

表1 各組用藥后不同時間腫瘤體積變化(，mm3)

組別 當天7 d 14 d 21 28 d 35 d 42 d陰性對照組 66.7±7.2 187.8±14.2c 608.7±113.3d1363.2±230.6e2850.5±365.7d3402.0±428.6e4040.8±452.6e順鉑 70.8±7.2 129.3±25.4a 383.2±54.0e 608.8±71.3c 500.7±92.9b 399.0±182.1b 388.3±187.1b赫賽汀低劑量組 71.9±7.4 196.0±16.0c 566.7±28.9d 960.0±41.6d 1597.5±478.8c1597.5±478.9d1597.5±478.9d赫賽汀高劑量組 61.8±13.5 149.0±18.0b 313.5±10.4b 320.7±36.2b 444.8±143.0b 437.2±188.0c 420.5±159.7c赫賽汀高劑量加順鉑組 63.7±8.4 138.0±10.4ab 261.3±14.2a 262.0±55.4a 247.8±60.0a 189.7±51.2a 189.7±51.2a

表2 各治療組腫瘤抑制率的比較(，%)

表2 各治療組腫瘤抑制率的比較(，%)

組別7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d順鉑 30.5±16.8a 52.6±3.9a 54.1±12.1b 82.5±1.2b 88.5±3.9b 90.57±3.6b赫賽汀低劑量組 4.7±8.1c 5.3±13.2b 27.7±16.9c 47.5±11.6c 52.5±16.6c 59.8±14.7c赫賽汀高劑量組 32.2±14.8a 54.8±5.4a 78.4±16.9a 85.4±4.4b 87.4±3.9b 89.7±3.0b赫賽汀高劑量加順鉑組 26.1±9.8b 56.1±8.8a 80.2±6.7a 91.1±2.9a 94.5±1.0a 95.3±1.0a

3 討論

原癌基因HER－2/neu又稱c－erbB－2癌基因，最先是由Shih等在鼠的神經母細胞瘤中發現。人類的HER－2/neu癌基因定位于第17號染色體長臂q11～q22，編碼分子量為185KD的跨膜糖蛋白，即HER－2/neu受體或稱P185，包括一個富含半胱氨酸的細胞外區，一個疏水的跨膜區和一個細胞內酪氨酸激酶區［10］。目前，通過限制過度表達的HER－2的異常功能來改善HER－2陽性乳腺癌患者的病程成為一種新的治療策略，人源化抗HER－2單抗赫賽汀是第一個針對HER－2陽性轉移性乳腺癌的以癌基因為靶的治療手段。目前三期臨床結果證實，赫賽汀對HER－2/neu過表達的腫瘤具有良好療效［11－12］。有文獻報道，對過表達HER－2/neu的轉移性乳腺癌，赫賽汀單藥治療的有效率達15% ～20%，與化療藥物(阿霉素、泰素、環磷酰胺等)聯合應用時，可以明顯提高療效［13］。由于赫賽汀在乳腺癌治療中取得的成功，因此在卵巢癌中針對HER－2的抗體靶向治療也已經逐漸引起國內外學者的重視。關于赫賽汀體外抗增殖活性的研究發現［14－15］，赫賽汀可使HER－2過度表達的乳腺癌細胞系SK－SB3Q生長受到有效抑制，對過度表達HER－2的卵巢癌和乳腺癌細胞系以及轉染HER－2癌基因小鼠細胞也有生長抑制作用。

腫瘤細胞的最基本特征之一是細胞的失控性生長。而失控性增生的重要原因之一就是細胞周期調控機制的破壞［16］。細胞增殖過程由細胞周期來完成，受細胞周期調控機制嚴格控制，并決定細胞的分裂、分化和凋亡等過程。故而，抑制或降低腫瘤細胞的增殖活性，是腫瘤治療的基本策略之一。Ki－67是反映細胞增殖的核抗原，在細胞周期的G1后期和M期細胞核表達，其免疫組化染色能檢測腫瘤的增殖特征，與腫瘤惡性程度、浸潤性、轉移、復發密切相關，能準確反映出腫瘤的性質，其表達水平反映細胞的實際增殖程度［17］。細胞核因子 －kB(nuc1ear factor of kappa B，NF－KB)是癌基因 Rel家族中2個亞基形成的二聚體，最常見的形式有p65和p50形成的二聚體。它是一種重要的轉錄調節因子，參與多種細胞增殖、凋亡，具有抗凋亡的作用［18］。近年有研究發現腫瘤細胞耐藥現象的產生也與NF－kB的活化有關［19］。

在本實驗中，對瘤體組織的Ki－67和NF－kB表達檢測結果顯示:實驗組中，除赫賽汀低劑量組外，其余各組腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI均低于陰性對照組組LI，兩兩比較發現:赫賽汀高劑量組腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI與順鉑組腫瘤組織的LI無統計學差異;而兩者聯合組的腫瘤組織Ki－67和NF－kB的LI則明顯低于前兩者單藥組的LI。由此提示，赫賽汀能夠明顯抑制腫瘤的增殖活性，其機制可能是通過下調Ki－67、NF－kB的表達水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖;且其與順鉑聯合使用時可進一步抑制腫瘤的增殖活性，兩者之間具有協同作用。

綜上所述，抗HER－2人源化單克隆抗體赫賽汀能夠抑制人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的生長，明顯延長荷瘤鼠生存時間，同時其與常規化療藥順鉑具有協同作用。赫賽汀是有望成為高表達HER－2卵巢癌的靶向性治療藥物;且在臨床作為手術、化療和放療的輔佐治療上有著廣闊的應用前景。

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