PDGF－A和MVD在大腸癌中的表達及預后意義

駱禮波，程家平，楊偉明，石 磊，賀新媛，楊雪峰，劉 勤，蘇曉玥，任 宇 (.遵義醫學院附屬醫院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563003;.遵義醫學院附屬醫院胃腸外科，貴州 遵義 563003)

大腸癌是常見消化道惡性腫瘤，影響患者預后是腫瘤的侵襲和轉移能力。早在1971年，Folkman等［1］就提出“腫瘤血管生長因子理論”，他們認為:腫瘤生長及轉移依賴于新生血管生成。在促進腫瘤血管生長諸多因子中，有VEGF家族，FGF家族及PDGF家族等，PDGF家族是研究相對較早因子之一。早在1973年，Ross［2］在人血清中發現了PDGF，其分子量為27～31 KD，為由A、B兩鏈組成的堿性蛋白質，因來源血小板而得名。PDGF家族成員包括PDGF－A，PDGF－B，PDGF－C，PDGF－D。多項研究表明，PDGF－A是該家族中研究最多，相對較成熟的腫瘤新生血管誘發因子。Sharma等［3］指出MVD最有價值的是能預測實體腫瘤的侵襲和轉移，并與實體腫瘤各種預后因素有關，是預測全身和局部復發及無病生存的重要指標。Katano等［4］報道:PDGF－A與胃癌關系密切，可能在胃癌預后中起重要作用。越來越多研究表明，PDGFA在多種腫瘤中過度表達，與腫瘤侵襲和轉移有關［5］，參與成纖維細胞，內皮細胞和平滑肌細胞等增殖，具有趨化性和促有絲分裂性能，可以促進結締組織并產生細胞外基質蛋白(ECM)及直接或間接導致腫瘤血管生成。閆巍中等［6］研究報道:血管生成素(angiogenin)中的促血管生成素－1(Ang－1)，促血管生成素－2(Ang－2)及促血管生成素受體－2(Tie－2)表達程度與大腸癌的進展期呈正相關，而運用PDGF－A和MVD對大腸癌患者生存期進行評估，國內外文獻鮮于報道。本研究運用免疫組化方法(Envision法)探討PDGF－A和MVD在大腸癌組織中表達與患者生存預后關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集我院胃腸外科1997年3月～2007年2月生存期≥5年(甲組)及≤3年(乙組)大腸癌患者組織標本各30例。所有標本均經病理證實為大腸癌組織，全部患者均為第一次手術，術前均未接受任何放療、化療和其他治療。甲組:男14例，女16例;年齡30～79歲，平均50.1歲。Dukes分期，A+B期18例，C+D期14例;有淋巴結轉移11例，無淋巴結轉移者19例。乙組:男18例，女12例;年齡27～73歲，平均56.1歲;Dukes分期，A+B期12例，C+D期16例;有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移者14例。60例中，29例未突破肌層，其余31例全部浸潤至漿膜及漿膜層外。分化程度方面，高分化腺癌28例、中低分化腺癌及黏液腺癌32例。

1.2 免疫組化試劑，儀器及其他耗材:特異性一抗是兔抗人PDGF－A多克隆抗體(編號bs－0196R，工作液濃度1:100)，購于北京博奧森公司;鼠抗人CD34單克隆抗體(工作液濃度1:100)購于福州邁新公司。二抗試劑盒(編號GK500705，包括Envision二抗檢測即用型，DAB顯色試劑)購于美國基因公司。經多聚賴氨酸處理的防脫玻片，PBS緩沖液，EDTA抗原修復液及一抗稀釋液均購于北京中杉金橋公司。另二甲苯，乙醇，雙氧水，蘇木素，微波爐均為實驗室自備。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化染色:石蠟組織切割成4 μm厚切片，均經HE染色再次確認原始組織學診斷后行免疫組化染色。二甲苯梯度脫蠟兩次，每次10 min，乙醇梯度水化，3%雙氧水浸泡10 min去除內源性過氧化物酶，EDTA微波修復抗原(CD34，PDGF－A均為10 min)，自然冷卻后PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加一抗后4℃過夜。第二次給予PBS液沖洗3次，每次5分鐘。滴加二抗，室溫30 min后再次PBS液沖洗3次，每次5分鐘。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹膠封片。以PDGF－A，CD34強陽性片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結果判定

1.3.2.1 PDGF－A判斷:PDGF－A主要表達于腫瘤細胞的細胞漿或胞膜上，在癌旁的間質中可見少量表達，以胞漿內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。每張切片選取10個不同部位，400倍視野下計數，按陽性細胞數占總細胞數的比例和染色深度進行評分和分級。染色強度分級:無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色及更深顏色為2分;陽性細胞分級:陽性細胞數≤50%為0分，＞50% ～75%為1分，＞75%為2分。兩項得分相加，結果2分為陽性表達。

1.3.2.2 MVD判斷:作為標記微血管最主要的CD34，以血管內皮細胞胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽性表達，MVD計數參照Maeda等報道方法［7］，計數5個高倍鏡視野(×200)內微血管數，取其平均數為該組織MVD值。以上免疫組化染色結果均由具備多年病理診斷經驗的技術人員2人采用雙盲法參與判定。

1.3.3 統計學處理:實驗結果采用SPSS17.0統計學軟件進行分析。計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關進行相關性分析。檢驗水準α=0.05，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDGF－A，MVD表達與性別，年齡，分化程度及病理分型關系:免疫組化顯示:大腸癌組織中PDGF－A主要表達于腫瘤細胞的胞漿或胞膜內，以胞漿內出現棕黃色或棕褐色顆粒陽性染色為主，而尤其以癌巢邊緣著色明顯，表明PDGF－A表達最明顯部位位于腫瘤細胞浸潤前緣，見圖1，腫瘤組織間質間可見少量表達。CD34是目前運用最多，較為成熟的標記微血管蛋白，以血管內皮細胞胞膜染成棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。主要表達于腫瘤間質區，微血管數量以腫瘤周邊相對較多，見圖 2。60例中，PDGF－A陽性表達率為53.3%(32/60)，MVD值為20～76，平均為41.05。兩者與性別、年齡、TNM分期、浸潤深度無關。見表1。

圖1 A大腸癌癌巢胞質內PDGF－A的表達(×400)

表1 大腸癌組織中PDGF－A.MVD的表達與臨床病理參數關系

圖2 A大腸癌癌巢間質內CD34的表達(×100)B大腸癌癌巢邊緣上CD34的表達(×400)

2.2 PDGF－A，MVD表達與病理學分級，淋巴結轉移間關系:PDGF－A，MVD在腫瘤細胞病理學分級的中低分化型，有淋巴結轉移的表達分別為65.6%(21/32)，70.4%(19/27);(45.72±11.87)，(44.37±12.50)均顯著高于高分化型，無淋巴結轉移的 39.3%(11/28)，39.4%(13/33);(35.71±9.37)，(38.33±10.65)差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 PDGF－A，MVD表達與生存期，患者預后關系:生存期≥5年大腸癌患者(甲組)與≤3年大腸癌患者(乙組)PDGFA，MVD表達分別為36.7%(11/30)，70.0%(21/30);(37.70±10.32)，(44.40±12.42)。差異較為顯著，有統計學意義(＜0.05)。研究發現，PDGF－A著色及陽性細胞數表達越多切片，相對應 MVD值越高。兩者呈正相關(r=0.965，P＜0.05)。

3 討論

Folkman指出:血管形成可根據腫瘤發展分為血管前期和血管期。在血管前期，實體瘤緩慢生長或不生長，多數直徑不超過1mm，很少向周圍浸潤，幾乎不發生轉移［8］。一旦進入血管期，腫瘤必須要建立自身的血管系統以獲得充足的氧和營養成分，生長速度隨之加快，瘤體向周圍侵襲。由于新生腫瘤血管內皮細胞不完整或基底膜中斷、缺如、脫落，腫瘤細胞容易進入血液循環，引起腫瘤侵襲，轉移。可以說，腫瘤血管的新生在腫瘤良惡性間，惡性腫瘤分期及淋巴結轉移間扮演了極其重要的角色。多項研究顯示，血管的新生需要多種誘發因子，如細胞因子，生長因子，ECM復合物等［9］。在這些血管生長因子中，PDGF與VEGF，FGF有相似的促血管生成作用。MVD是腫瘤微血管形成程度的標志和腫瘤的生物學特征，是評價腫瘤血管生成狀態的最佳指標。已有多項研究表明，在乳腺癌、腎癌、頭頸部腫瘤等的MVD高低與腫瘤復發和轉移密切相關。

PDGF促進血管生成的機制可能為:①腫瘤細胞和血管內皮細胞都表達PDGF受體，因此，PDGF在腫瘤表達上可起自分泌或旁分泌作用。②通過間接途徑即激活鄰近組織細胞或平滑肌細胞釋放VEGF，FGF等生長因子促進血管生成。③參與并促進惡性腫瘤間質反應，PDGF與其受體結合可提高ECM降解及促進腫瘤侵襲，轉移過程。在腫瘤浸潤轉移過程中發揮重要作用。本試驗表明，生存期≥5年大腸癌患者在淋巴結轉移方面，其PDGF－A陽性率，MVD數值與≤3年大腸癌患者比較，差異有統計學意義。PDGF－A對大腸癌的生長和轉移可能有促進作用，PDGF－A和MVD可以作為判斷大腸癌患者預后的重要參考指標。但其病理學分級間的顯著差異與辛林等［10］報道PDGF－A與病理學分級無關，而與Dukes分期呈正相關不相符合。PDGF－A與病理學分級相關原因不清楚，國內曾有在口腔鱗狀細胞癌中PDGF－A與病理學分級有密切聯系的報道。關于在大腸癌中這兩者之間關系報道甚少，需要深入探討研究。

［1］Weidner N.Tumor angiogenesis:review of current applications in tumor prognostication［J］.Sem in Diag Pathol，1993，10(4):302.

［2］Ross R.Platelet derived growth factor［J］.Annu Rnnu Rev Med ，1987，38:71.

［3］Sharma S，Sharma MC，Sarkar C，et al.Morphology of angiogenesis in human cancer:a conceptual overview.histoprgnostic perspective and significance of neoangiogenesis［J］.Histopathology，2005，46(5):481.

［4］Katano M.，Nakamura M，Fujimoto K，et al.Prognostic value of platelet－derived growth factor－A in gastric carcinoma［J］.Ann Surg，1998，227(3):365.

［5］Mah Becherd MCM ，Ceraline J，Deplaneque G，et al.Anti－angiogenic effects of the thieno pyridino SR 25989 invitro and in vivo in a murine pulmonary metastasis model［J］.Br J Cancer，2002，86(5):803.

［6］閆巍中，溫春陽.大腸癌組織中Ang－1，Ang－2及受體Tie－2的表達及意義.吉林醫學，2011，12(13):2501.

［7］Maeda K，Chung YS，Ogawa Y，et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma［J］.Cancer，1996，77(5):858.

［8］Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis denpendent［J］.J Natl Cancer Inst，1990，82(1):4.

［9］Cross MJ，Claesson－Welsh L.FGF and VEGF function in angiogenesis:signaling pathways.biological responses and therapeutic inhibition［J］.Trends Pharmacol sci，2001，22(4):201.

［10］辛 林，彭洪云.大腸癌PDGF和VEGF基因mRNA表達研究［J］.大腸肛門病外科雜志，2002，18(1):24.