β-連環蛋白和環氧化酶-2在舌癌中的表達及其相關性

王 鵬 李 樂 蘇哲君 霍 峰 王笑茹 李春輝 (承德醫學院附屬醫院口腔科，河北 承德 067000)

目前有關 β-連環蛋白(β-catenin)、環氧化酶-2(Cox-2)在腫瘤發生發展和侵襲轉移的研究日益受到人們的關注〔1，2〕。本研究采用免疫組織化學的方法檢測舌癌組織及正常口腔黏膜中β-catenin、Cox-2的表達情況，探討兩者在舌癌發生發展及轉移過程中的作用及相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集承德醫學院附屬醫院口腔科2006～2011年手術切除及活檢后經病理診斷明確的存檔舌癌標本60例，男37例，女23例，年齡40～75歲，平均55.3歲。所有患者手術前均未經放療、化療或免疫治療;所有舌癌病例均經承德醫學院附屬醫院病理科資深醫師組織病理學證實，病理診斷標準參照2002年《頭頸部腫瘤病理學與遺傳學》，病理分型為高分化19例，中分化26例，低分化15例。伴有淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者28例。收集舌外傷、舌修整正常舌黏膜組織30例作為正常對照。

1.2 標本處理 檢測標本置40 g/L的中性甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.3 主要試劑及儀器 Cox-2(美國Santa Cruz)、β-catenin鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz);SP染色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.4 方法 S-P法免疫組化染色:采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細胞和組織中的抗原。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS液處理，分步滴加一抗、生物素標記二抗及過氧化物酶溶液進行孵育，DAB顯色;復染，逐級脫水，透明，封片。

1.5 結果判定標準 β-catenin免疫組化陽性信號為細胞內出現棕黃色細小顆粒，染色判斷標準按照文獻〔3〕研究方法。細胞膜表達減弱或缺失及異位表達統稱為異常表達。Cox-2表達結果判定:細胞質或細胞膜或細胞核呈棕褐色或棕黃色(細顆粒)為Cox-2陽性細胞。在高倍鏡下(×100)隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，計算平均百分率。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用Fisher精確概率檢驗法;相關分析使用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 β-catenin和Cox-2在正常舌黏膜及舌癌中的表達 見圖1。β-catenin在正常舌黏膜中全部明顯表達，主要定位于細胞膜，僅少數胞質弱表達，未見核表達。正常口腔黏膜組織中Cox-2均為陰性表達。在舌組織中，β-catenin異常表達率為72%，主要為細胞膜表達減弱，向胞質或胞核轉位，出現異常表達，或胞膜胞核都不表達，而且大多數伴有不同程度細胞膜表達缺失。Cox-2在舌癌組織中陽性表達定位于腫瘤細胞胞質，為棕色顆粒，陽性表達率80%。

2.2 β-catenin和Cox-2表達與舌癌臨床病理特征的關系 見表1。β-catenin和Cox-2表達與年齡、性別無關，β-catenin異常表達與腫瘤TNM分期和有無淋巴結轉移相關(P＜0.01)，Cox-2陽性表達與組織分化程度、腫瘤TNM分期和有無淋巴結轉移相關(P＜0.01)。

圖1 β-catenin、Cox-2蛋白的表達(DAB，×100)

2.3 β-catenin和Cox-2在舌癌中表達的相關性 β-catenin與Cox-2的表達呈正相關(r=0.867，P＜0.001)。

表1 β-catenin和Cox-2表達與舌癌臨床病理特征的關系(n)

3 討論

β-catenin是一種由連環蛋白基因編碼的多功能蛋白質。正常情況下，β-catenin僅表達于細胞膜，少量表達于胞質細胞質，在胞核內無表達。具有參與細胞黏附與Wnt通路信號傳導雙重功能，對于維持上皮細胞的組織結構完整和抑制腫瘤的侵襲及新陳代謝過程起著重要的作用〔3〕。腫瘤細胞中的Wnt信號通路異常可促使腫瘤的發生。Wnt通路活化后，胞質中游離β-catenin蛋白增多，使β-catenin在胞質內積聚，并轉移至細胞核與轉錄因子Tcf/Lef結合，形β-catenin-TCF/LEF轉錄復合體，激活下游相關基因 c-myc、Cox-2、cyclinD1等，導致腫瘤發生〔4〕。多項研究〔5～7〕表明，β-catenin 在細胞膜表達減少可使細胞失去黏附功能導致細胞分散，癌細胞表型改變獲得高侵襲性，易于發生浸潤與轉移。本研究結果表明，β-catenin可能在舌癌的細胞黏附和腫瘤細胞浸潤轉移方面發揮了重要作用。

在許多促炎和致突變因素的刺激下，Cox-2可被誘導出來，參與病理過程。有研究表明，Cox-2對于淋巴結的轉移可以提供有益條件，Cox-2還直接改變腫瘤細胞表型，促進腫瘤細胞浸潤侵襲的機制。Cox-2可以通過PGE2來參與調控腫瘤的生長與分化，PGE2通過G蛋白耦聯途徑等來促進細胞的生長，Cox-2也可能通過誘導Bcl-2等的表達從而導致腫瘤的發生。郭貴龍等〔8〕研究表明Cox-2參與并促進了腫瘤新生血管的發生發展。O'Connor等〔9〕研究發現Cox-2的水平與預后有密切關系，Cox-2水平較高的預后較差。本實驗發現，Cox-2在舌癌中陽性表達率為80%，并與組織分化程度、TNM分期和有否無淋巴結轉移相關，但在正常組織中未見表達。舌癌組織中Cox-2高表達，可能與其誘導細胞增殖、抑制凋亡、增強腫瘤的侵襲性及轉移活性，促進血管內皮生長因子(VEGF)生成從而促進腫瘤血管的形成有關〔10〕。結果提示，Cox-2可能是一個判斷舌癌進展的惡性程度有價值的指標。

舌癌的發生發展涉及多個基因、分子水平的異常，舌體組織癌變是由多個因素參與及共同作用的結果。本研究提示βcatenin、Cox-2蛋白在舌癌的發生發展過程中相互影響，它們之間可能存在特殊的調控關系，其作用機制有待于進一步探討。

1 Kim I，Kwak H，Lee HK，et al.β-Catenin recognizes a specific RNA motif in the cyclooxygenase-2 mRNA 3'-UTR and interacts with HuR in colon cancer cells〔J〕.Nucl Acids Res，2012;40(14):6863-72.

2 Chiang SL，Chen PH，Lee CH，et al.Up-regulation of inflammatory signalings by areca nut extract and role of cyclooxygenase-2 a polymorphism reveal risk of oral cancer〔J〕.Cancer Res，2008;68(20):8489-98.

3 Gao S，Eiberg H，Krogdahl A，et al.Cytoplasmic expression of E-cadherin and beta-catenin correlated with LOH and hypermethylation of the APC gene in oral squamous cell carcinomas〔J〕.Oral Pathol Med，2005;34(2):116.

4 Lim K，Han C，Dai Y，et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acids inhibit hepatocellular carcinoma cell growth through blocking β-catenin and cyclooxygenase-2〔J〕.Mol Cancer Ther，2009;8(11):3046-55.

5 Moon RT，Kohn AD，de Ferrari GV，et al.Wnt and beta-catenin signaling:diseases and therapies〔J〕.Nat Rev Genet，2004;5(9):691.

6 Takahashi M，Tsurtoda T，Sdki M，et al.Identification of membrane-type matrixmetalloproteinase-1 as a target of the beta-catenin/Tef4 complex in human colorectal cancers〔J〕.Oncogene，2002;21(38):5861.

7 張衛民，高 巖.Wnt信號傳導通路組成蛋白與口腔鱗狀細胞癌的分化和增殖〔J〕.中華口腔醫學雜志，2005;40(6):491.

8 郭貴龍，姚榛祥.環氧化酶-2在人乳腺癌中的表達及對腫瘤血管形成的影響〔J〕.中華外科雜志，2004;42(20):1271-2.

9 O'Connor JK，Avent J，Lee RJ，et al.Cyclooxygenase-2 expression correlates with diminished survival in invasive breast cancer treated with mastectomy and radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006;58(4):1034-40.

10 王維麗，張英懷，張杰英，等.口腔鱗狀細胞癌中COX-2、VEGF和EGFR的表達及意義〔J〕.現代口腔醫學，2006;20(3):277-80.