不同濃度的胰島素樣生長因子－1對糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響

王 鈺 劉學政 (遼寧醫學院基礎學院人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病患者皮膚抵抗能力極差，很易破損感染，加上糖尿病血管病變會導致患者局部組織缺血、缺氧，糖尿病神經病變能導致患者局部感覺減退甚至消失而易于損傷。因此，糖尿病皮膚潰瘍是一種比較頑固的慢性潰瘍疾病，如果治療不及時就會向深部發展，最后甚至導致患者截肢，嚴重影響患者的生活質量〔1，2〕。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是體內分布極為廣泛的生長因子之一，與胰島素原高度同源，有促細胞分化和增殖活性，幾乎所有組織和細胞都能分泌，其生物學功能還可通過自分泌和旁分泌來實現〔3，4〕。有實驗證明IGF-1是參與創面炎癥反應、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過程的細胞因子之一，能夠提高創面愈合速率和愈合質量〔5〕。本實驗觀察不同濃度的外源性IGF-1對糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響，旨在找到最佳濃度、性價比最高的IGF-1的濃度，為其應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 健康雄性Wistar大鼠，3月齡，由遼寧醫學院動物實驗中心提供;IGF-1，上海康成生物工程有限公司;兔抗鼠基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、兔抗鼠MMP抑制物-1(TIMP-1)抗體，美國NEOMARKERS公司。

1.1.2 儀器與設備 倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS;電子分析天平，上海方瑞儀器廠生產(A2104型);高壓蒸汽消毒鍋，上海博訊實業公司(GYZ-2000型);72型分光光度計，上海天普分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對照組(n=5)、模型組(n=5)和實驗組(n=20)，實驗組再分成四組，給予不同濃度的IGF-1 0.5，1，1.5，2 mg/L。

1.2.2 糖尿病大鼠模型的制備 模型組和實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg誘發糖尿病，48 h后當大鼠血糖＞16.7 mmol/L時，認為糖尿病模型制備成功〔6〕。造模過程中失敗的大鼠隨時給予補充，取20只造模成功的實驗組大鼠進行皮膚潰瘍模型治療。

1.2.3 皮膚潰瘍樣本制備及干預 2 w后，于大鼠的背部人工制作2 cm×2 cm的方形創面，深達皮下組織，形成皮膚潰瘍創面〔7〕。皮膚創面形成后，將實驗組的20只大鼠隨機均分為4組(n=5)，分別給予0.5、1、1.5、2 mg/L 的 IGF-1 進行干預，每次每個創面給液量0.1 ml，對照組和模型組給予等量生理鹽水，無菌紗布包扎，隔日換藥，換藥時將無菌紗布揭開，常規消毒后，創面均勻噴灑IGF-1溶液，然后再用無菌紗布包扎，持續換藥20 d。

1.3 主要觀察指標

1.3.1 潰瘍面積 透明膜描記記錄傷后第5、10、15、20天創面面積，肉眼觀察肉芽組織生長和再上皮化情況，創面愈合程度按照愈合率0～100%標準進行評估，100%表示完全愈合。

1.3.2 電子顯微鏡及組織學觀察 第20天創面成纖維細胞及蘇木素-伊紅(HE)染色切片觀察毛細血管肉芽組織的生長情況。于各時間點將各組創面區標本做冰凍切片后，立即電子顯微鏡觀察成纖維細胞的生長情況;其余標本浸入中性多聚甲醛/磷酸鹽緩沖液(PBS)中固定、石蠟包埋、切片和脫蠟至水，進行HE染色，觀察各組創面肉芽組織生成情況。

1.3.3 免疫組織化學鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)法檢測 MMP-9、TIMP-1〔8，9〕于創面損傷后第 5、10、15、20 天取潰瘍創面組織，體積分數10%甲醛固定、脫水，石蠟包埋，進行免疫組化染色測量MMP-9和TIMP-1的表達。每次染色均設有PBS(代替一抗)的陰性對照。圖像分析利用Leica圖像分析系統，在400倍視野下，隨機選取5個視野，測定陽性表達細胞的平均灰度值。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，實驗數據用s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 潰瘍面積肉眼觀察 不同處理組治療后潰瘍狀況均隨時間的延長而縮小，其中對照組為自然愈合，好轉狀況較好，而糖尿病模型組愈合率最差;各給藥組創面大體觀亦有不同形式好轉，其中IGF-1質量濃度為0.5、1.0 mg/L時效果一般，較模型組有好轉但不如正常愈合;而2.0 mg/L時，第5天效果最好，但隨著時間的延長，效果越來越差。統計學分析可見，劑量為1.5 mg/L IGF-1最為理想，且好于對照組。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠皮膚創面損傷面積的比較(%)

2.2 電子顯微鏡觀察皮膚潰瘍創面的愈合情況

2.2.1 各組創面區肉芽組織形態 正常對照組大鼠正常愈合，可見成纖維細胞，隨著愈合時間的增加炎性細胞減少，組織結構變得清晰，基質增加，毛細血管較多。模型組無論是成纖維細胞還是新生血管數目明顯偏少，但各實驗組肉芽生長迅速，可見大量成纖維細胞;成纖維細胞增殖活躍，聚集成群，胞質豐富，輪廓較清晰，膠原纖維束排列密集而有序，愈合良好，可見大量毛細血管生成;但1.5 mg/L組成纖維細胞數量及形態好于其他三組，2.0 mg/L組較0.5 mg/L和1.0 mg/L實驗組愈合明顯提前，上皮覆蓋較明顯，但比1.5 mg/L組差，病理切片觀察愈合情況為1.5 mg/L組最好。見圖1。

圖1 HE染色觀察皮膚潰瘍創面愈合后肉芽組織(×200)

2.2.2 電鏡下觀察成纖維細胞的形態 正常對照組成纖維細胞規則分布，周圍可見膠原纖維，排列緊密;模型組少見成纖維細胞分布，周圍組織炎癥侵入。而實驗組給予IGF-1干預后第20天可見成纖維細胞體積增大，細胞形態良好且規則，胞質內可見內質網、線粒體、溶酶體、高爾基復合體等細胞器豐富，周圍可見大量膠原纖維，排列整齊、有序，說明IGF-1可以促進創面的愈合，效果好于正常對照組。見圖2。

2.3 不同時點各組皮膚組織MMP-9/TIMP-1表達水平 與對照組比較，糖尿病造模后皮膚傷口MMP-9表達水平顯著增高，均在第10天時達高峰，之后逐漸下降。IGF-1不同劑量組各數據結果均低于模型，證明應用IGF-1可緩解皮膚潰瘍，隨著時間的增加，MMP-9表達水平均呈下降趨勢，0.5、1.0 mg/L時效果相近，2.0 mg/L時第5天達峰值，隨后下降，但仍高于對照組和1.5 mg/L組，可見大劑量給藥后能夠短暫地緩解皮膚潰瘍，不適于長期應用。證明1.5 mg/L是最佳給藥劑量。見表2。

在糖尿病造模后皮膚傷口TIMP-1表達顯著降低，在第10天時達峰值，之后逐漸下降，且低于對照組。隨著IGF-1治療劑量的增加，TIMP-1表達呈上升趨勢，劑量為0.5、1.0 mg/L組TIMP-1水平高于模型組，第5、10天時低于對照組，而第15、20天時雖然呈下降趨勢，但結果仍高于對照組;劑量為1.5 mg/L時，與對照組比較差異無顯著性意義;劑量為2.0 mg/L時第5、10天開始效果顯著，隨著給藥時間的延長，各指標恢復到0.5、1.0 mg/L組水平，三組比較無顯著性差異。證明1.5 mg/L是最佳給藥劑量。見表3。

圖2 電鏡觀察皮膚潰瘍創面愈合后成纖維細胞形態(×15 000)

表2 不同時間點各組MMP-9表達水平比較(s)

表2 不同時間點各組MMP-9表達水平比較(s)

對照組 － 28.37±2.12 34.81±1.28 20.68±2.14 11.31±1.20模型組 － 26.25±1.33 37.17±2.42 32.38±1.24 25.21±2.13實驗組 0.5 21.46±2.09 30.40±1.76 23.25±2.06 24.01±2.09 1.0 22.29±1.67 25.21±2.34 21.17±2.31 22.87±2.08 1.5 26.95±1.092)30.73±2.011)19.58±2.101)10.24±2.161)2.0 27.07±2.112)3.80±2.05 22.74±2.15 21.54±2.07

表3 不同時間點各組TIMP-1表達水平比較(s)

表3 不同時間點各組TIMP-1表達水平比較(s)

對照組 － 60.37±2.161)80.09±3.021)40.38±3.641)10.18±5.201)模型組 － 39.78±1.25 49.34±3.15 37.18±4.05 8.07±3.44實驗組 0.5 49.38±2.25 60.44±2.47 45.18±3.23 20.35±2.04 1.0 50.68±3.02 68.57±3.11 44.27±2.24 18.09±3.01 1.5 58.25±3.121)78.63±5.071)41.31±2.531)12.18±3.161)2.0 62.52±2.69 73.50±2.14 46.27±3.15 17.06±2.14

3 討論

糖尿病皮膚創傷修復是一個復雜的生物學過程，涉及創面炎癥反應、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過程，很多細胞因子參與和調控〔10〕。由各種細胞分泌的細胞因子在正常傷口愈合中發揮著至關需要的作用。傷口的愈合包括炎癥反應、上皮形成、新血管發生、基質形成和膠原合成，最終傷口愈合。IGF是體內重要的生長因子，以自分泌、旁分泌等方式對組織細胞的增殖、分化、凋亡，以及機體的生長發育、腫瘤的發生發展起重要的調節作用。

在創面愈合過程中，IGF-1發揮著重要的生理作用，其來源主要是創面以外來源的IGF-1，它與成纖維細胞增殖、活躍程度密切相關。傷口內IGF-1表達量的變化與成纖維細胞和Ⅰ型膠原的變化相關，IGF-1與Ⅰ型膠原的分泌和創面愈合有著固有的內在聯系，成纖維細胞產生的Ⅰ、Ⅲ型膠原是主要的間質膠原，也是皮膚結締組織中的主要膠原類型;它不僅能填充組織缺損，同時還為表皮細胞遷移提供支架，所以創面中成纖維細胞是否增生活躍直接影響著創面的愈合時間〔11，12〕。

本實驗結果顯示，IGF-1具有顯著促進糖尿病大鼠背部潰瘍愈合的作用，表現為明顯減小創面面積，顯著提高愈合率并縮短平均愈合時間，促進創面新生血管生成和肉芽組織生長及再上皮化，進而使肉芽組織生長活躍，創面收縮與再上皮化明顯，效果接近并好于對照組。根據IGF可改善創面局部血液循環、促進創面毛細血管再生、加速創面愈合的原理，目前已有很多相關藥物應用于臨床。

MMPs在創面基質降解和皮膚的重塑過程中具有重要作用，其與創面愈合纖維化、瘢痕形成和慢性創面愈合速度密切相關〔13〕。近年來的研究表明MMPs/TIMPs含量失調是形成慢性創面的重要因素。正常傷口愈合過程中，MMPs/TIMPs在清除壞死物、細胞遷移和細胞外基質降解重塑過程中起著重要作用〔14〕。朱平等〔14〕研究認為，正常皮膚的 MMP-9/TIMP-1 始終維持在一個動態平衡的穩定水平，MMPs發生變化的同時其生理性拮抗劑TIMP也發生了相應變化，這種平衡不但有利于局部傷口的修復，同時又防止了局部有關物質的過度破壞和堆積。

本研究說明，采用IGF-1治療糖尿病皮膚潰瘍是一種安全、有效的方法，可以明顯改善糖尿病皮膚潰瘍的愈合速率，提高愈合質量。

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