厄洛替尼對人胰腺癌細胞凋亡及survivin蛋白表達的影響

王 原 陳 紅 房 芳 楊照環 王海波 劉華群

(河北聯合大學附屬醫院消化科，河北 唐山 063000)

胰腺癌早期癥狀隱匿，超過70%的胰腺癌患者確診時已是中晚期，易發生轉移，預后惡劣〔1〕。有報道胰腺癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的陽性率接近50%，參與了胰腺癌的發生、發展和轉移。厄洛替尼為人表皮生長因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，廣泛應用于治療胰腺癌的基礎和臨床研究。本研究從細胞水平進一步觀察厄洛替尼對胰腺癌細胞增殖抑制、促進凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株PANC-1購自中國科學院上海細胞生物學研究所。噻唑藍(MTT)購于美國Sigma-aldrich公司。RAD001用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 mmol/L貯備液，實驗時用RPMI1640培養液稀釋至實驗所需濃度。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒KGA107購于南京凱基生物科技發展有限公司，山羊抗兔SP免疫組化染色試劑盒SP-9001購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人survivin sc-10811多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 MTT比色法檢測細胞增殖變化 調節PANC-1細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板中，每組設6個復孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150 ml DMSO，振蕩10 min選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計算各組細胞抑制率=〔(空白對照組OD值－各實驗組OD值)/空白對照組OD值〕×100%。

1.3 胰腺癌PANC-1細胞凋亡的檢測 收集厄洛替尼作用24、48、72 h及空白對照組的細胞，調整細胞密度為1×107個/ml，取 25 μl的細胞懸液與 1 μl的 AO/EB 染液混勻。吸取上述10 μl的混合液置于一潔凈的載玻片上，蓋玻片封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 survivin蛋白的表達情況 Western印跡檢測胰腺癌PANC-1細胞中survivin蛋白的表達情況。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，所有實驗重復3次，結果數據用s表示，組間比較用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 厄洛替尼對胰腺癌PANC-1細胞生長的抑制情況 MTT比色法結果顯示:厄洛替尼能明顯抑制胰腺癌PANC-1細胞的生長，隨用藥時間的延長和用藥濃度的提高，抑制率明顯增強(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度、不同時間厄洛替尼對胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響

2.2 厄洛替尼對細胞凋亡的影響 12.5 μmol/L厄洛替尼作用24、48、72 h的PANC-1細胞凋亡率(%)分別為9.51±1.38，14.50±1.65，16.6±1.89。作用48 h后早期凋亡細胞開始減少，而晚期凋亡和壞死細胞上升，表明厄洛替尼通過早期誘導細胞凋亡繼而導致細胞壞死。

2.3 Western印跡檢測結果 與對照組比較，厄洛替尼作用48 h后胰腺癌PANC-1細胞中survivin蛋白表達不同程度下降(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤發生、發展和藥物抵抗的發生機制與腫瘤細胞的凋亡相關〔2〕。因此，誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤最常見的形式。厄洛替尼是一種小分子的TKI，主要通過與三磷酸腺苷競爭結合至EGFR胞內酪氨酸激酶功能域，抑制受體自磷酸化而阻止下游信號傳導，從而抑制細胞周期進程，加速細胞凋亡，抑制血管生成，進而產生抗腫瘤作用〔3〕。

survivin高表達于絕大多數惡性腫瘤組織中，而在正常組織中不表達。研究表明，survivin的陽性高表達能抑制胃癌細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖〔4〕。Vaira等〔5〕將 mTOR下游底物p70S6K-cDNA轉染入前列腺癌DU145細胞，發現了明顯的survivin表達上調;而用小干擾RNA(siRNA)沉默內生p70S6K表達之后，出現survivin表達水平下降，說明survivin基因參與腫瘤的發生機制。本研究發現應用厄洛替尼處理后的胰腺癌PANC-1細胞增殖明顯受到抑制，同時其survivin蛋白的表達也明顯降低。分析其機制，由于survivin表達具有細胞周期依賴性，只在細胞周期的G2/M期表達，應用厄洛替尼后可使癌細胞阻滯于G1期，從而降低了survivin的表達水平，進而促進細胞凋亡。可以進一步推測，厄洛替尼通過下調survivin的表達，進而干擾胰腺癌的凋亡。同時，應用厄洛替尼競爭性結合EGFR，使EGFR對VEGF的調控能力降低，從而降低了VEGF導致的survivin的高表達。

厄洛替尼通過下調survivin蛋白的表達來誘導人胰腺癌細胞PANC-1凋亡。本研究不僅可以闡明厄洛替尼對胰腺癌凋亡的調控，同時從細胞水平為其抗腫瘤浸潤提供了新的治療思路和實驗依據。

1 Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011;144(5):646-74.

2 崔 斐，陳 斌，陳錦章，等.凋亡抑制蛋白 Survivin和血管內皮生長因子在肝細胞癌中的表達及其臨床意義〔J〕.南方醫科大學學報，2008;28(5):761-3.

3 劉顯紅，馬麗霞，張 爽，等.厄洛替尼治療吉非替尼失敗后晚期非小細胞肺癌的療效〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(24):4790-1.

4 李鳳朝，孔慶兗，楊雪梅.Survivin表達與胃癌細胞凋亡、增殖及腫瘤血管形成的關系〔J〕.實用癌癥雜志，2004;19(6)592-4.

5 Vaira V，Lee CW，Goel HL，et al.Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19):2678-84.