綠色木霉(Trichoderma virens)T43對沙棘干縮病的抑制效果及其抑菌機理

焦喜來 尹大川 Ilan Chet 鄧 勛 宋瑞清*

(1.黑龍江豐林國家級自然保護區管理局，黑龍江 伊春 153033；2.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.以色列耶路撒冷希伯萊大學 農學院)

沙棘(Hippophaerhamnoides)是多年生的灌木或小喬木，具有極強的生態適應性，對于防風、固沙、防止水土流失、治理生態環境方面具有重要意義[1]。沙棘干縮病是世界范圍內危害沙棘最嚴重的毀滅性病害，是所有沙棘栽培區都可能出現的危險性病害。研究發現引起沙棘干縮病的病原菌為擬枝孢鐮孢菌(Fusariumsporotrichoides)[2～3]，沙棘干縮病的發生、蔓延是目前困擾沙棘產業化發展的重要因素。此病造成提前落葉，常常較健康樹木提早30d以上落葉，造成樹勢早衰、有效壽命縮短，連續發病3～4年可致死亡，果實品質下降，產量損失達40%以上，對沙棘危害極大[4]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應性強和多機制性的特點。對多種病原菌有抑制作用。此外還具有重寄生作用，通過胞外酶破壞病原菌細胞壁，削弱病原菌的生長勢，甚至殺死病原菌。目前世界范圍內已有以木霉菌為主要成分的生物殺菌劑，在農林業生產中發揮重要作用[5～6]。同時，木霉菌對植物還具有促生抗逆的作用，通過定殖和次生代謝產物促進植物生長，提高其抗病能力[6]。本研究選用自以色列引進的木霉菌株T43及其次生代謝產物，研究其對沙棘干縮病病原菌的抑制效果和抑菌機理，為進一步有效控制沙棘干縮病打下基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

實驗所用木霉菌株T43和擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichoides)由東北林業大學林學院林木病理教研室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株T43對擬枝孢鐮孢菌的拮抗效果

采用平板對峙培養法。在直徑90mm的PDA平板上，相距50mm分別接入直徑10mm、培養5d的木霉菌株和病原菌株的菌片。以在平板中心接種直徑10mm的各菌株菌片作為對照。每處理3個重復，置于25℃恒溫培養箱中培養。4d后用十字交叉法測量菌落的趨向半徑，計算抑制率、相對抑制效果和拮抗系數。

被抑制率={[(單獨培養菌落半徑)-(菌落趨向半徑)]/(單獨培養菌落半徑)}×100%

相對抑制效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率

1.2.2 菌株T43非揮發性代謝產物對擬枝孢鐮孢菌的抑制作用

預實驗結果表明，乙酸乙酯作為萃取劑獲得的提取物抑菌效果較高，適宜的萃取比例為發酵液∶乙酸乙酯=1∶3(V/V)。因此該研究采用乙酸乙酯作為萃取劑，對T43發酵液進行萃取，以獲得非揮發性代謝產物，即乙酸乙酯提取物。

木霉菌株發酵液的制備：用直徑10mm打孔器切取培養好的木霉菌株菌落，分別接入盛有300mL PD培養基的三角瓶(500mL)中，每瓶接種4片，置于搖床(25℃、120r/min)上培養5d，獲得發酵液。無菌紗布過濾后，取濾液備用。

乙酸乙酯提取物的制備：乙酸乙酯與濾液按1∶3(V/V)的比例混合，常溫靜置2d，分液去除無機相后，低壓旋轉蒸發去除有機溶劑，將所得固體樣品用5mL 10%的吐溫80溶解，除菌過濾，即得乙酸乙酯提取物樣品。

抑菌活性檢測：采用混合培養基法。將5mL乙酸乙酯提取物與500mL PDA培養基均勻混合，制成平板，中央接種直徑為10mm的病原菌株菌片，置于25℃的恒溫培養箱中培養4d，測量菌落直徑大小(十字交叉)。以含10%吐溫80的無菌水作對照，每個處理3個重復。根據以下公式計算抑菌率。

抑菌率=[(對照凈生長量-處理凈生長量)/對照凈生長量]×100%

1.2.3 木霉菌株T43發酵液提取物對病原菌抗氧化保護酶的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是植物體中典型的抗氧化保護酶，所以本研究選擇這三種酶進行抑菌機理的初步探究。

無菌條件下切取病原菌株平板培養菌落，用無菌水沖洗2～3次，吸干水分。室溫下，將菌片分別用菌株T43發酵液提取物浸泡2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h，以無菌水浸泡菌片作為對照。

(1)SOD粗酶液制備：稱取不同處理時間的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.8的冷磷酸緩沖液，冰浴研磨，冷凍離心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[7]。單位定義：每克菌絲體在1mL反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位。

(2)CAT與POD粗酶液制備：稱取不同處理時間的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.0的冷磷酸緩沖液，冰浴研磨，冷凍離心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[8]。

3種酶的活性測定使用南京建成公司生產的試劑盒。

2 結果與分析

2.1 菌株T43對擬枝孢鐮孢菌的拮抗效果

對峙培養96h后，菌株T43對病原菌生長抑制率為44%，相對抑制效果為0.75，木霉菌株生長速度快，競爭系數高，在同病原菌對峙培養中，迅速占領生態位。而病原菌開始生長較快，但在與木霉接觸后生長受到抑制，在木霉的抑制下幾乎停止生長，并最終與木霉形成明顯的拮抗線(圖1)。

2.2 菌株T43乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果

在培養96h后，病原菌菌落直徑明顯小于對照組，說明木霉菌株發酵液提取物對病原菌生長具有一定的抑制作用(圖2)，其抑制率為46.10%，其菌絲也較對照組稀疏，生長較弱且生長緩慢。

2.3 菌株T43發酵液乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌抗氧化保護酶的影響

菌株T43發酵液乙酸乙酯提取物對擬枝孢鐮孢菌抗氧化保護酶均有不同程度的影響(圖3～圖5)。

(1)對超氧化物歧化酶(SOD)的影響：木霉菌株T43發酵液乙酸乙酯提取物對病原菌SOD有明顯的抑制作用(圖3)。經乙酸乙酯提取物處理后，病原菌SOD在4～10h出現短暫的上升之后，在10h時達到峰值，為68μg/g，在10h后直線下降，出現了明顯的拐點，與對照組形成鮮明的對比。

(2)對過氧化氫酶(CAT)的影響：木霉菌株T43發酵液乙酸乙酯提取物對病原菌CAT有明顯的抑制作用(圖4)。經乙酸乙酯提取物處理后，病原菌CAT在4～8h出現短暫的上升之后，在8h時達到峰值，為0.049μg/g，在8h后直線下降，出現了明顯的拐點，24h降到最低為0.01μg/g。對照組在達到最高后數值趨于平穩。

(3)對過氧化物酶(POD)的影響：木霉菌株T43發酵液乙酸乙酯提取物對病原菌POD有明顯的抑制作用(圖5)。經過處理后，病原菌SOD在4～10h出現短暫的上升之后，在10h時達到峰值，為6μg/g，在10h后直線下降，出現了明顯的拐點，24h降到最低為2μg/g。對照組則一直上升，最后穩定在8μg/g。

3 結論

通過木霉菌株T43對沙棘干縮病菌的抑制效果及其抑菌機理的初步研究，得出以下結論：(1)木霉菌株T43對擬枝孢鐮孢菌具有一定的拮抗效果；(2)菌株T43乙酸乙酯提取物中含有抑菌活性成分，抑制沙棘干縮病病原菌的生長；(3)菌株T43乙酸乙酯提取物可顯著降低病原菌3種抗氧化保護酶(SOD、POD、CAT)活性，對病原菌的膜保護系統有一定的破壞作用。

參考文獻：

[1]楊芳.沙棘的研究進展[J].第一軍醫大學分校學報，2004，27(1):79～81.

[2]宋瑞清，孫海珍，等.黑龍江沙棘干縮病病原菌的研究[J].林業科學，2010,46(9):88～95.

[3]宋瑞清，孫海珍，等.黑龍江省沙棘干縮病病原菌生物學特性的研究[J].林業科技，2009,34(2):20～22.

[4]杜漢君.沙棘干縮病發病規律及成因的調查與分析[J].沙棘，2001，14(1):13～15.

[5]Lewis J A , Papavizas G C. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media[J].Soil Biol. Biochem,1983,(15):3512357.

[6]Lewis J A , Papavizas G C. Chlamydospore formation by Trichoderma spp. innatural subst rates[J].Can J. Microbiol,1984,(30):127.

[7]鄧龍,鄧勛,尹大川，等.引進木霉菌株T-43對樟子松枯梢病菌的抑制效果[J].黑龍江生態工程職業學院學報,2012,25(3):38～39.

[8]張芹.松針褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素致病作用的細胞學研究[D].南京:南京林業大學學位論文,2003.