高血氨對大鼠血清膽紅素及肝組織血紅素加氧酶1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1表達的影響

王彥芳，闞全程#，余祖江，李朵璐，關克磊

1)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052

肝臟是氨的主要代謝場所，血氨濃度增高與肝損害有關，主要表現為對神經系統和肝臟有很強的毒性[1]。Bhatia等[2]的研究發現動脈血氨濃度>124 μmol/L與重型肝性腦病和腦水腫發生相關。動物實驗[3]證實膽紅素可作為機體的抗氧化物質發揮極強的抗氧化作用。臨床中發現血氨濃度與膽紅素水平正相關，但氨致膽紅素代謝紊亂的具體機制尚不清楚。目前，國內外關于氨引起星形膠質細胞代謝及形態改變的機制研究較多[4],但是關于氨對肝細胞的毒性，尤其是對肝臟中酶活性的影響研究甚少。作者針對臨床上出現的高血氨合并高膽紅素的現象，構建高血氨動物模型，觀察氨對血清總膽紅素(total bilirubin,TBIL)與直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)水平、膽紅素代謝相關的血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1)的誘導作用及對核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影響，闡明氨對膽紅素代謝的阻礙作用，以期為臨床降氨藥物的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器25只雄性清潔級Wistar大鼠購自鄭州大學實驗動物中心，合格證編號SCXK(豫)2005-0001，體質量180～230 g。NH4Cl(生工生物工程上海股份有限公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司)，RevetAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒、DreamTap Green PCR Master Mix(Fermentas公司)，Rat TBIL ELISA 試劑盒(RD，CK-E91034R)，Rat DBIL ELISA 試劑盒(RD，CK-E91035R)，兔抗-HO-1/HSP32抗體(北京博奧森生物技術有限公司，bs-0827R)，鼠抗NF-κB P65抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司，sc-8008)，山羊血清封閉液(武漢博士德生物工程有限公司，AR0009)。PCR儀(S1000TMThermal Cycler，BIORAD)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，熒光顯微鏡，德國蔡司公司；微量分光光度計NanoDrop 2000，Thermo科技公司，酶標儀，MultiskanMK3。

1.2高血氨大鼠模型的建立25只大鼠分為2組。高血氨組15只：每天早上8點和下午4點按100 mL/g給予100 g/L的NH4Cl灌胃；對照組10只，給予等量生理鹽水；共灌胃4周。實驗中高血氨組死亡3只。

1.3大鼠血清TBIL、DBIL水平測定采用ELISA法。每周心臟采血1次，3 000 r/min離心后取上清，96孔板每孔加上清10 μL、稀釋液40 μL、HRP標記的抗體反應液50 μL，37 ℃溫箱中孵育1 h。洗滌液洗板5次甩干，每孔加反應液A和B各50 μL，37 ℃溫箱中孵育15 min，每孔加終止液100 μL，酶標儀上檢測405 nm處的吸光度值，按標準曲線計算TBIL或DBIL的水平。

1.4大鼠肝組織HO-1和NF-κB的檢測灌胃4周后心臟灌流摘取其肝臟，取部分用4 g/L的多聚甲醛固定。常規石蠟切片，脫蠟至水；pH 6.0檸檬酸修復抗原；滴加體積分數3%的H2O2封閉內源性過氧化物酶；山羊血清封閉內源性生物素。滴加一抗(兔抗-HO-1抗體按1400稀釋；鼠抗NF-κB P65抗體按1300稀釋)，4 ℃過夜；滴加二抗，50 μL/片，37 ℃ 30 min；滴加辣根酶標記卵霉鏈白素； DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照。用Image-Pro Plus 6.0分析，以單位面積內陽性物質積分光密度值作為HO-1蛋白的相對表達量。NF-κB陽性細胞百分比的統計：每組計數5張圖片中的100個細胞，計算陽性細胞百分比。

1.5大鼠肝組織UGT1A1mRNA的檢測采用RT-PCR法。采用異硫氰酸胍一步法提取肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。UGT1A1引物序列：上游5’-CCTCTCTGGAACAAAGCCACT-3’，下游 5’-AAG GCAGTTTATCCCACCAAT-3’，擴增產物大小為431 bp； GAPDH引物序列：上游5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，下游5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’ ,擴增產物大小為595 bp，由生工生物工程上海股份有限公司合成。反應總體系為25 μL：DreamTap Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR 產物以20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。以目的條帶和GAPDH條帶光密度值的比值作為UGT1A1 mRNA的相對表達量。

1.6統計學處理采用SAS 9.1處理數據。采用重復測量數據的方差分析比較2組大鼠不同時間點血清TBIL和DBIL水平，采用兩獨立樣本的t檢驗比較處理4周后2組大鼠肝臟組織HO-1蛋白的相對表達量、NF-κB陽性細胞百分比及UGT1A1 mRNA的表達水平，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組大鼠血清TBIL與DBIL水平比較高血氨組TBIL和DBIL水平明顯高于對照組，見表1、2。

表1 2組大鼠血清TBIL水平比較 μmol/L

F組間=201.524，F時間=446.552，F交互=89.223，P均<0.001。

表2 2組大鼠血清DBIL水平比較 μmol/L

F組間=131.864，F時間=455.413，F交互=57.882，P均<0.001。

2.2 2組大鼠肝組織HO-1和NF-κB的表達見圖1。HO-1 陽性物質呈棕黃色，主要定位于胞質。高血氨組HO-1蛋白的相對表達量為(2 250.31±620.43)，較對照組的(156.66±10.28)上調(t=56.829，P<0.001)。NF-κB被激活后轉移至胞核，胞核呈棕黃色者為陽性。高血氨組可見核內染色加深，陽性細胞百分比為(0.248±0.052)%，較對照組的(0.072±0.033)%增加(t=62.347，P<0.001)。

圖1 2組大鼠肝組織HO-1和NF-κB的表達(SP，×400)

2.3 2組大鼠肝組織UGT1A1mRNA的表達RT-PCR結果見圖2。高血氨組UGT1A1 mRNA的表達水平(0.611±0.152)高于對照組的(0.328±0.063)(t=6.449，P<0.001)。

圖2 2組肝組織UGT1A1 mRNA的表達

3 討論

HO-1是影響膽紅素生成的關鍵酶，同時也是評估細胞氧化損傷的重要參考指標[5]。該實驗中高血氨組大鼠肝組織HO-1的表達增強，預示著大鼠肝細胞已處于氧化應激狀態。另有文獻[6]報道在星形膠質細胞中NH4+介導的氧化壓力導致HO-1過表達，而直接的氧化物清除劑?；撬岷屯屎谒乜梢杂行б种芅H4+介導的HO-1過表達。NF-κB廣泛存在于各種細胞中，通常與IκB 結合，使細胞中NF-κB 處于p50-p65-IκBβ多聚體的無活性狀態，錨定在細胞質。當細胞受到細胞因子、脂多糖、氧自由基等刺激時，IκB發生磷酸化并迅速降解，激活的NF-κB向核內轉移，調控相應基因的轉錄。近來研究[7]發現，NF-κB和MAPK通路可被活性氧激活，HO-1 的啟動子區域含有NF-κB 結合位點，NF-κB 激活后可上調HO-1的表達。該實驗中高血氨組大鼠肝組織出現NF-κB的核內轉移增加并伴有HO-1的過表達，與上述研究相符。文獻[7]也報道梗阻性黃疸發生時，肝臟中的NF-κB 被顯著激活，出現核移位，體內產生大量的活性氧簇。而在星形膠質細胞中，NF-κB 的快速活化參與了膽紅素所致的神經毒性損傷[8]。

膽紅素是血紅素的代謝產物，在肝臟微粒體UGT酶的催化下，間接膽紅素轉變為DBIL而排泄。其中UGT1A1 和UGT1A5被稱為膽紅素代謝群，尤其以UTG1A1的作用最明顯[9]。生理水平的膽紅素可以保護細胞膜抵抗脂質過氧化，其氧化能力甚至超過了維生素C和E[10]。已有實驗[3]證明了膽紅素對抗間二硝基苯所致的氧化應激作用，同時證明HO-1活力的升高在氧化應激時起到了提高膽紅素水平的作用。該實驗中，高血氨組大鼠經NH4Cl灌胃4周后，肝組織UGT1A1 mRNA的表達明顯升高，推測可能是HO-1活力升高后提高UGT1A1底物(膽紅素水平)的結果。而長期慢性HO-1上調釋放的鐵離子和CO會加重細胞氧化應激損傷，進一步導致膽紅素水平的升高和UGT1A1的持續性高表達。諸多研究[9,11-12]也證實，UGT除了受孕烷X受體、組成型雄甾烷受體等孤兒核受體調節外，還與其底物膽紅素有關。

該研究結果表明，大鼠經NH4Cl灌胃4周后，肝細胞已處于氧化應激狀態，導致了NF-κB的核內轉移增加，NF-κB 激活后上調HO-1的表達。HO-1的過表達是氨介導的氧化壓力的結果，而UGT1A1的升高亦可能是HO-1活力升高后提高其底物(膽紅素水平)的結果。但是有關HO-1對膽紅素代謝及其代謝酶調控的詳細機制還有待進一步闡明。

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