血栓前狀態分子與冠心病血瘀證的相關性研究

王 萍，黃獻平，王麗萍，喻松仁，孫安會，袁肇凱

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.江西中醫學院，江西 南昌330000）

血栓前狀態(Prethrombotic state，PTS)，既往稱血液高凝狀態，是在血管內皮細胞及凝血、抗凝、纖溶系統以及血流動力學等多種因素改變的綜合作用下發生的一種病理過程。現代醫學認為冠心病具有一定的遺傳性，且普遍存在著血栓前狀態，而血瘀證作為中醫證候概念下許多疾病的一種血液運行不暢的病理階段，被認為與PTS 有著密切的關系。血瘀證是冠心病有規律的一種病理表型，其血栓前狀態分子是否存在著一定遺傳性值得探討，本研究以具有遺傳特征的家系人群為對象，探討PTS 分子與冠心病血瘀證的關系，同時對冠心病血瘀證非家系人群進行同步對照研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象

冠心病血瘀證患者來源于2010年1月～2011年l月湖南中醫藥大學第一附屬醫院、湖南省中醫藥研究院附屬醫院心內科住院病人以及在長沙砂子塘社區、梨子山社區、長沙冶金研究設計院等單位進行冠心病血瘀證遺傳流行病學調查中符合診斷標準和納入標準的冠心病人。“冠心病” 診斷參照1979年國際心臟病學會/美國心臟協會及WHO 冠心病診斷標準，須排除疾病的診斷均按相關的國際診斷標準進行。冠心病“血瘀證”的診斷參照《中華人民共和國中醫藥行業標準·中醫病癥診斷療效標準》及國家中藥管理局醫政司胸痹急癥組和中國中醫藥學會心病專業委員會《中醫心病診斷療效標準與用藥規范》進行。“冠心病血瘀證家系”定義為先證者的一級親屬(包括父母、同胞及子女)中至少有1 人為冠心病血瘀證患者。

本研究納入對象基本情況如下：A 組：家系冠心病血瘀證組，24 例，其中男14 例，女性10 例，平均年齡（65.38±9.64）歲；B 組：家系冠心病非血瘀證組，9 例，其中男1 例，女性8 例，平均年齡（69.89±8.07）歲；C 組：家系非冠心病血瘀證組，14 例，其中男5例，女性9 例，平均年齡（62.43±8.27）歲；D 組：家系健康人組，10 例，其中男4 例，女性6 例，平均年齡（43.70±20.54）歲；E 組：非家系冠心病血瘀證組，21例，其中男6 例，女性15 例，平均年齡（69.24±6.40）歲；F 組：非家系健康人對照組，7 例，其中男3 例，女性4 例，平均年齡（55.29±11.16）歲。IBM SPSS statistics 19.0 軟件對各組間性別構成和平均年齡進行分析，結果差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 研究方法

納入對象均于清晨空腹靜脈取血，分離血漿或血清，按各血栓前狀態分子標記物檢測要求進行測定。其指標如下 （1）血管內皮細胞損傷分子標記物：血漿血栓調節蛋白（TM）；（2）血小板活化分子標記物：血小板表面P-選擇素（P-Selectin）；（3）凝血系統激活及微量纖維蛋白形成分子標記物：凝血酶原片段1、2（F1+2）、可溶性纖維蛋白單體（SFMC）；（4） 纖溶系統分子標記物：組織型纖溶酶原激活物（tPA）、纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）；（5）抗凝系統分子標記物：凝血酶-抗凝血酶III 復合物（TAT）。

各血栓前狀態分子標記物的檢測均按照ELISA試劑盒說明書進行。酶標儀450 nm 波長檢測各孔的吸光度 （OD 值）。測定在加終止液15 min 內進行。

2 結果

2.1 標準品曲線擬合

各指標檢測出標準品OD 值，根據OD 值與已知標準品濃度進行曲線擬合，此處采用MasterPlex 2010 軟件進行二次多項式（y=a+bx+cx^2）擬合。

2.2 PTS 分子標記物的計算

運用上述標準曲線，計算出各組相應的分子標記物值。由于實驗誤差所致，各組值通過IBM SPSS statistics 19.0 進行分析，剔除離群值和極端值進行分析。各組的PTS 分子標記物的平均濃度如表1。

表1 各組PTS 分子標記物的平均測定濃度 （±s）

表1 各組PTS 分子標記物的平均測定濃度 （±s）

組 別 n TM (μg/L) n P-Seletin (pg/mL) n F1+2 (nmol/L) n SFMC (μg/mL) n t-PA (μg/L) n PAI-1 (ng/L) n TAT (pmol/mL) A 23 19.33±5.97 22 367.41±93.99 24 895.75±449.44 23 45.83±17.66 23 12.17±3.57 23 705.37±224.44 24 27.87±8.55 B 7 14.08±1.88 8 287.32±41.34 8 668.78±222.46 8 29.63±2.12 8 9.30±1.08 8 559.98±75.82 7 18.58±2.07 C 11 15.08±1.36 12 326.41±72.82 11 615.32±84.75 12 36.25±12.12 11 9.16±0.68 9 488.75±37.84 12 20.05±5.75 D 9 13.78±1.57 9 294.77±21.09 9 535.22±106.25 9 32.61±6.28 9 9.50±0.54 9 550.25±70.58 9 19.95±2.03 E 17 13.95±1.44 18 306.24±34.28 18 503.80±115.32 18 32.68±4.28 19 9.00±0.77 20 523.65±120.89 20 19.16±4.18 F 7 26.00±15.01 7 519.70±298.09 6 803.56±437.01 6 48.44±21.73 6 12.84±4.85 5 625.10±232.74 7 29.83±14.65

2.3 PTS 分子標記物的統計分析

各組結果采用IBM SPSS statistics 19.0 進行分析，由于各組間方差齊性分析P＜0.05，方差不齊，故采用oneway annova (Tamhane)進行各組間的均數比較。結果如下：

2.3.1 家系冠心病血瘀證與家系各組間比較。TM:冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證和健康人比較均有統計學差異 （P 值分別為0.016，0.048，0.005），TM 的含量較后三者高。P-Selectin：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證和健康人比較有統計學差異 （P 值分別為0.048，0.031），P-Selectin 含量較后二者高，與非冠心病血瘀證比較無統計學差異（P=0.938）。F1+2：冠心病血瘀證與健康人比較有統計學差異（P=0.015），F1+2 含量較后者高，與冠心病非血瘀證和非冠心病血瘀證無統計學差異（P=0.674，0.096）。SFMC：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證有統計學差異 （P=0.004），SFMC 含量較后者高，與非冠心病血瘀證和健康人比無統計學差異（P=0.657，0.058）。t-PA：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證及健康人比較均有統計學差異 （P=0.028，0.010，0.028），t-PA 含量較 后 三者高。PAI-1：冠心病血瘀證與非冠心病血瘀證有統計學差異（P=0.002），含量較后者高，與冠心病非血瘀證和健康人比較無統計學差異 （P=0.160，0.086）。TAT：冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證、非冠心病血瘀證及健康人比較均有統計學差異 （P =0.001，0.042，0.003），含量較后三者高。

2.3.2 非家系兩組間的比較。冠心病血瘀證各血栓前狀態分子與健康人比較均無統計學差異 （TM：P=0.705，P-Selectin：P=0.817，F1+2：P=0.920，SFMC：P=0.889，t -PA：P =0.828，PAI -1：P =0.999，TAT：P =0.806）。

3 討論

TM 是一種普遍存在于細胞膜表面具有較強抗凝活性的跨膜糖蛋白。有研究表明TM 的下降與血瘀證存在著線性關系[1]，本研究結果表明家系冠心病血瘀證的TM 水平較家系健康人高，也高于家系冠心病非血瘀證和家系非冠心病血瘀證，與其他研究結果不一致。而t-PA 和PAI-1 是纖溶系統的主要成分，是纖溶系統關鍵性調節物質，二者之間的動態平衡對維持正常的血液流動具有重要意義。研究發現[2-3]，冠心病患者的血漿t-PA 活性減低，PAI-1 活性增高，但本研究結果表明家系冠心病血瘀證的PAI-1 水平與家系健康人比較無明顯差異，而t-PA 水平高于家系健康人，也與其他研究結果不一致。凝血酶原片段1+2（F1+2）是在血液凝固過程中因子Xa 復合物水解凝血酶原后所生成的多肽片段。檢測F1+2 在血漿中的水平，可較靈敏地反映Ⅹa 的活性及凝血狀態，在冠心病患者的研究中也較健康人水平增加[4]。P-選擇素(P-Selectin)介導血小板黏附于內皮細胞，激活中性粒細胞，釋放血管活性物質和氧代謝產物，導致血管收縮，阻塞小血管從而啟動血栓形成過程，其在CHD 的發生發展中起著重要作用[5-6]。TAT 是凝血酶被抗凝血酶III 中和后形成的，能使凝血酶被滅活，是反映凝血酶生成和活性增高的敏感分子標志物，在冠心病中較健康人水平增加[7]。本研究結果表明家系冠心病血瘀證患者P-Selectin、F1+2、TAT的血漿水平較健康人組高，與其他研究結果相同。

家系人群研究中冠心病血瘀證患者與健康人比較能抑制凝血的分子TM、t-PA 水平增加，促進凝血的P-Selectin、F1+2、TAT 等分子水平也增加。為何這兩種相互拮抗的分子同時增加，是后續研究需要探討的問題。這種現象在冠心病血瘀證與冠心病非血瘀證比較中也有體現。

在非家系的人群研究中冠心病血瘀證與健康人比較，各種PTS 分子的水平均無明顯差別。從數據分析可知，非家系人群的PTS 分子水平在個體間差異較大，這是否是由于研究設計或檢測方法的缺陷所致，還是說明PTS 分子在家系人群中具有較為穩定的遺傳表現特征，也是值得繼續研究的方向。

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