忽地笑加蘭他敏生物合成代謝途徑中COMT酶基因克隆及序列分析

桂柳姿，崔培梧，潘清平，唐金鳳，魯耀邦

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410208；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東；4.中藥藥性與藥效三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410208）

忽地笑（Lycoris aurea），又名黃花石蒜，是石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜屬(Lycoris Herb.)多年生草本植物，其在生長(zhǎng)繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生多種生物堿，其中加蘭他敏（Galanthamine）是一種芐基乙胺類生物堿[1]，屬乙酰膽堿酯酶抑制劑[2]，為治療阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s Disease，AD）的首選藥物之一。由于化學(xué)合成加蘭他敏成本高昂，目前藥用加蘭他敏主要從石蒜科植物的鱗莖中提取分離得到[3]。在本課題組的前期研究中，比較了黃花石蒜花蕊和花葶組織中總RNA 的提取方法[4]，以及使用以RNA 差異顯示法篩選黃花石蒜中加蘭他敏合成相關(guān)基因[5]。

目前認(rèn)為加蘭他敏在植物體內(nèi)的生物合成途徑主要分為六個(gè)步驟，首先是原兒茶醛與酪胺（tyramine）合成降孤挺花啶(norbelladine)，然后降孤挺花啶在兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶 (catechol-O-methytransferase，COMT)的催化下接受一個(gè)甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧-甲基降孤挺花啶，而4-氧-甲基降孤挺花啶是加蘭他敏、文殊蘭胺（crinine）、石蒜堿（lycorine）等石蒜科生物堿的共同前體[3]。COMT 是一種S-腺苷-L-甲硫胺酸（SAM）依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶，目前在煙草（Nicotiana tabacum）[6]、罌粟（Papaver somniferum）、唐松草（Thalictrum tuberosum）[7]和玉米（Zea mays）[8]等多種植物中被克隆。而本實(shí)驗(yàn)首次從忽地笑克隆COMT 酶基因并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 忽地笑花瓣于2012年7月10日采自湖南衡山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室潘清平教授鑒定后于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 RNAprep pure 植物總RNA 提取試劑盒(TIANGEN，北京)，SuperScriptTMIII Firststrand Synthesis System （Invitrogen，美國(guó)）、3’Full RACE Core set Ver.2.0、5’ Full RACE kit、pMD19-T Vector、Primer STARRHS DNA Polymerase、LA Taq、A-Tailing 試劑盒、Eoli.DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(大連寶生物公司)，QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGEN，德國(guó)），BIOWEST AGAROSE（Genetech，美國(guó)），100 bp DNA ladder Marker（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器 5332 PCR 儀、Biophotometer 6131 核酸蛋白分析儀（Eppendorf，德國(guó)），HE-120 Gen 多功能水平電泳槽、Tanon Eps300 型恒壓恒流電泳儀、GZS-1000B 凝膠圖像處理系統(tǒng) (上海天能科技有限公司)，恒溫震蕩培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市華美生化儀器廠），潔凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），MV-100 微型真空離心濃縮儀 (日本TOMY 公司)，TGL-18M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀高速離心機(jī)有限公司），超純水系統(tǒng)（北京帕思特科技有限公司），THA-3560C 高壓滅菌鍋（造鑫企業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 忽地笑花瓣總RNA 提取 從-80 ℃取出忽地笑花瓣，用植物總RNA 提取試劑盒提取其總RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。提取后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性，并用核酸蛋白儀檢測(cè)其濃度，剩余量存于-80 ℃中。

1.2.2 忽地笑花瓣cDNA 第一鏈的合成 以總RNA 為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，合成后存于-20 ℃。

1.2.3 忽地笑COMT 基因部分序列的克隆 參照NCBI 中已發(fā)表的高等植物的COMT 氨基酸序列同源區(qū)，利用Primer Premier5 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)簡(jiǎn)并引物L(fēng)aCOMT-R 和LaCOMT-F（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收片段，連接轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選，再取白色菌落送交至長(zhǎng)沙博尚公司測(cè)序。

1.2.4 3’RACE 和5’RACE 擴(kuò)增根據(jù)已獲得的COMT 基因的部分序列，利用Primer Premier5 軟件及Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)3’RACE 和5’RACE 的特異性引物3R1、3R2、5R1 和5R2（表1），其分別與試劑盒提供的3’RACE Out Primer、3’RACE Inner Primer、5’ RACE Out Primer 和 5’RACE Inner Primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。3’ RACE Out PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。3’RACE Inner PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，53 ℃50 s，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Out PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃30 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min，25 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Outer PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃10 s，55.2 ℃15 s，72 ℃90 s，20 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Inner PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃90 s，30 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收片段，連接轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選，再取白色菌落送交至上海生工測(cè)序。

1.2.5 忽地笑COMT 基因全長(zhǎng)的獲得 使用序列拼接軟件ContigExpress 對(duì)測(cè)序獲得的3’RACE 與5’RACE 片段進(jìn)行拼接，得到COMT 基因的全長(zhǎng)序列。

表1 忽地笑COMT 基因PCR 擴(kuò)增引物

1.2.6 忽地笑COMT 基因序列的生物信息學(xué)分析

（1） 核苷酸性質(zhì)分析 使用NCBI 提供的在線ORF Finder 尋找基因的編碼框；并使用BLAST搜索克隆的LaCOMT 氨基酸序列的同源序列，分析其的同源性。

（2） 蛋白質(zhì)分析 用ProtParam 軟件（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線分析La-COMT 基因編碼蛋白質(zhì)的分子量，等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等；用ProtScale 軟件（http://www.expasy.ch/tools/protscale.html）在線分析蛋白質(zhì)的親/疏水性；用SignalP 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；用TMHMM 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM） 在線檢測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)使用SOPMA 軟件（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/nps a_sopma.html） 在線分析；三級(jí)結(jié)構(gòu)使用SWISSMODEL 軟件（http://swissmodel.expasy.org/）在線自動(dòng)建模。

（3） 基于COMT 氨基酸序列的物種進(jìn)化分析使用DNAMAN 軟件將NCBI 中不同物種的13 種與LaCOMT 氨基酸序列具有一定同源性的序列進(jìn)行比對(duì)，并用Observed Divergency 的距離模式將其集合在一起繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

用簡(jiǎn)并引物L(fēng)aCOMT-R 和LaCOMT-F 對(duì)忽地笑cDNA 第一鏈進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到1 段492 bp堿基序列（圖1A）。根據(jù)這條序列為3’ RACE 與5’RACE 的巢式PCR 設(shè)計(jì)特異性引物，最后得到La-COMT 基因的3’端片段約600 bp（圖1B）和5’端片段約850 bp （圖1C）。通過序列拼接軟件ContigExpress 對(duì)3’ 端片段與5’ 端片段進(jìn)行拼接，得到La-COMT 基因的全長(zhǎng)序列約1300 bp，再通過NCBI 網(wǎng)站上的ORF finder 在線軟件分析LaCOMT 基因的開放讀碼框，結(jié)果顯示LaCOMT 基因序列有12 bp 的polyA 結(jié)構(gòu)和1101 bp 編碼的366 aa 的開放閱讀框。

2.2 兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖1 LaCOMT 的PCR 擴(kuò)增

在NCBI 網(wǎng)站上通過BLAST 比對(duì)出LaCOMT 基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其不僅與其他植物的氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）具有一定的同源性，而且與其他植物的咖啡酸氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（CAOMT）也具有較高的同源性。使用DNAMAN 軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)忽地笑COMT 與荷蘭鳶尾（Iris x hollandica）CAOMT 的同源性最高，與罌粟（Papaver somniferum）、唐 松 草（Thalictrum tuberosum）和煙草（Nicotiana tabacum）COMT 的同源性次之，而玉米（Zea mays）COMT 與蜀黍（Sorghum bicolor）、葦狀羊茅 （Festuca arundinacea） 和黑麥草（Lolium perenne）CAOMT 聚為一類 （圖2）。由于COMT 與CAOMT 均屬于依賴S-腺苷-L-甲硫胺酸（SAM） 的氧位甲基轉(zhuǎn)移酶，通過上述分析可推斷COMT 與CAOMT 在進(jìn)化過程中具有一定的保守性，其進(jìn)化來源也可能具有一定的同源性。

2.3 LaCOMT 編碼蛋白序列與其他植物COMT 同源性比對(duì)分析

通過上述的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析后，再進(jìn)一步分析LaCOMT 與其他植物COMT 同源性，發(fā)現(xiàn)其與忽地笑、唐松草、煙草和玉米的同源性高達(dá)74%，且具有依賴SAM 的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的三個(gè)保守區(qū)：(V/I/L)VDVGGGXG、VPX (A/P/G)DAXXMKWI 和 AL PXXGKVIXXEXILP（圖3）。

圖2 基于忽地笑兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因的不同物種的基因進(jìn)化樹

圖3 LaCOMT 氨基酸序列與其他植物兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶比對(duì)結(jié)果

2.4 忽地笑兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白特性分析

2.4.1 LaCOMT 蛋 白 理 化 性 質(zhì) 分 析 根 據(jù)Prot-Param 在線軟件預(yù)測(cè)表明，LaCOMT 蛋白分子式為C1824H2861N467O527S23，分子量為40501.9；等電點(diǎn)pI 為5.95；帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為42，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為36；穩(wěn)定系數(shù)為38.13，該值在40 以下，說明LaCOMT 蛋白單體是穩(wěn)定的；脂肪系數(shù)為90.63；總平均親水性為-0.037，同時(shí)結(jié)合ProtScale 在線軟件預(yù)測(cè)LaCOMT 蛋白的親/疏水性氨基酸分布圖（圖4）表明，親水性氨基酸和疏水性氨基酸較均勻的分布于整個(gè)氨基酸序列中，故此蛋白單體沒有明顯的疏水性；估計(jì)體外半衰期為30h。含量較高的氨基酸依次為L(zhǎng)eu （9.6% ）、Ala（7.9%）、Lys （7.7%）、Ile （7.4%）、Gly （7.1%）、Ser（6.8%）、Asp（5.7%）、Glu（5.7%）、Val（5.7%）和Pro（5.5%）。

圖4 LaCOMT 蛋白疏水性分析圖

2.4.2 LaCOMT 蛋白氨基酸序列信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析 用SignalP 在線軟件對(duì)LaCOMT蛋白的N 端的前70 bp 氨基酸片段進(jìn)行的信號(hào)肽檢測(cè)表明，其C 值、S 值和Y 值的計(jì)算結(jié)果均為NO，且平均值少于0.5，預(yù)測(cè)出此蛋白無(wú)信號(hào)肽（圖5），推斷LaCOMT 蛋白為非分泌蛋白。用TMHMM在線軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)出此蛋白無(wú)跨膜區(qū)，推斷LaCOMT 酶發(fā)揮功能的部位不結(jié)合于生物膜上。

圖5 LaCOMT 蛋白信號(hào)肽分析圖

2.4.3 LaCOMT 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)LaCOMT 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，有168 個(gè)氨基酸可形成α 螺旋，54 個(gè)氨基酸可形成延伸帶，23 個(gè)氨基酸可用于形成β 轉(zhuǎn)角，其余121 個(gè)氨基酸可形成無(wú)規(guī)卷曲。

2.4.4 LaCOMT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SWISSMODEL 預(yù)測(cè)LaCOMT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，采用自動(dòng)模式建模，預(yù)測(cè)出LaCOMT 基因編碼的蛋白對(duì)應(yīng)1kyzE 模型（圖6A）的E 值為4.05e-141，序列的一致性為67.61%，1kyzE 是植物中咖啡酸氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的模板，LaCOMT 亦具有甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，說明以1kyzE 模型為樣板預(yù)測(cè)的LaCOMT 單體三級(jí)結(jié)構(gòu)圖是可靠的（圖6B）。

圖6 忽地笑兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)獲得忽地笑兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（LaCOMT）基因序列后，通過分析其開放閱讀區(qū)編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其具有依賴S-腺苷甲硫胺酸（SAM）的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的三個(gè)保守區(qū)[9]：(V/I/L)VDVGGGXG、VPX (A/P/G)DAXXMKWI 和AL PXXGKVIXXEXILP，SAM 的作用是在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下為底物提供甲基，故此保守序列可初步說明此次實(shí)驗(yàn)所克隆得到的序列為COMT 基因序列。同時(shí)對(duì)COMT 進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)LaCOMT 與來源于煙草、唐松草、玉米和罌粟的COMT 的同源性高達(dá)74%，這進(jìn)一步說明此次實(shí)驗(yàn)所得的序列為COMT 序列。本實(shí)驗(yàn)克隆的LaCOMT 基因讀碼框共1101bp，共編碼366 個(gè)氨基酸，與梁麗建等[10]研究的石蒜COMT（LrCOMT）基因編碼的氨基酸數(shù)目一致，但氨基酸序列有所不同。

LaCOMT 基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明該基因編碼的蛋白質(zhì)穩(wěn)定，為非分泌性蛋白，其酶促作用的發(fā)生不結(jié)合生物膜。COMT 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及LaCOMT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明COMT 與咖啡酸氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（CAOMT）具有較高的同源性，各自作用于不同底物，分別為兒茶酚胺類化合物和5-羥基松伯醇[11]，并且CAOMT 也是依賴SAM 的一種甲基轉(zhuǎn)移酶，可初步推斷COMT 與CAOMT 在進(jìn)化可能具有同一祖先且COMT 在進(jìn)化上具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦浴?/p>

Eichhom 等[12]以Leucojum Amaestivum 為 材 料通過放射性和重同位素標(biāo)記生物合成的可能前體，研究加蘭他敏的生物合成途徑，推測(cè)出加蘭他敏的生物合成的可能途徑主要有五個(gè)步驟，首先確定了降孤挺花啶在兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下獲得一個(gè)甲基轉(zhuǎn)變?yōu)?-氧甲基降孤挺花啶，再按照以下路線進(jìn)行轉(zhuǎn)化：4-氧甲基降孤挺花啶→N-去甲那維定→N-去甲加蘭他敏→加蘭他敏。加蘭他敏和那維定可以相互轉(zhuǎn)變。后來，Dewick[3]在其書中對(duì)加蘭他敏多生物合成途徑進(jìn)行了補(bǔ)充，其認(rèn)為降孤挺花啶由原兒茶醛與酪胺合成，但依舊沒能指出生物合成途徑中其他各步驟中需要的酶類。本研究對(duì)忽地笑COMT 基因進(jìn)行了克隆及序列分析，為忽地笑加蘭他敏生物合成關(guān)鍵酶基因研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及研究思路。但忽地笑加蘭他敏生物合成途徑的其它酶促反應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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