脫氫表雄酮硫酸酯對地佐環(huán)平所致記憶小鼠的作用及對NMDA刺激的PC12細(xì)胞鈣離子的影響

摘 要： 為了探討脫氫表雄酮硫酸酯對地佐環(huán)平所致記憶小鼠的作用及對PC12細(xì)胞鈣離子的影響。本研究采用地佐環(huán)平（0.15mg·kg■，ip）造成小鼠記憶損傷模型，利用被動逃避實(shí)驗(yàn)評價小鼠記憶成績。培養(yǎng)的PC12細(xì)胞用Fura-2/AM負(fù)載，用熒光分光光度計(jì)測量PC12細(xì)胞鈣離子變化。在被動逃避實(shí)驗(yàn)中，地佐環(huán)平造成小鼠記憶損傷，脫氫表雄酮硫酸酯（10、20mg·kg■，sc）預(yù)處理能減少跳臺錯誤次數(shù)（P<0.01），延長跳臺潛伏期（P<0.01）和避暗潛伏期（P<0.01）。NMDA刺激的PC12細(xì)胞模型[Ca■]■明顯增高（P<0.05），脫氫表雄酮硫酸酯（100μmol·L■）預(yù)處理后與模型組相比[Ca■]■明顯增高（P<0.01）。研究結(jié)果表明，脫氫表雄酮硫酸酯可以改善地佐環(huán)平所致記憶損傷，機(jī)制可能與其能提高NMDA受體功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 脫氫表雄酮硫酸酯 地佐環(huán)平 記憶 PC12 Ca■

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠（清潔級，合格證號№SCXK滬2002-0002，購自本校實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部），♂，體重20～25g，自由進(jìn)食水和飼料。試驗(yàn)前3d，使小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，每日9：00～15：00在隔音的環(huán)境中進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與制劑

脫氫表雄酮硫酸酯（Sigma公司，批號111K1539）；地佐環(huán)平（Sigma公司，批號022K4611）；Fura-2/AM；NMDA（Fluka公司，批號425618/1）HEPES（批號060517，購自華美生物工程公司）；RPMI1640（1285082，購自GIBCOTM Invitrogen Corporation）；胰蛋白酶。

1.3動物實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組和給藥方案

1.3.2跳臺實(shí)驗(yàn)

訓(xùn)練時先將小鼠放在反應(yīng)箱中適應(yīng)3min，然后通以35V、50Hz的電流，小鼠受到電擊的正常反應(yīng)是跳上平臺，如此訓(xùn)練5min。24h后測驗(yàn)，記錄5min內(nèi)錯誤次數(shù)及第1次跳下平臺的潛伏期。如果5min時小鼠仍未跳下平臺，則潛伏期記為300s。

1.3.3避暗實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置分為明暗兩室，暗室底部銅柵可通以電流。訓(xùn)練時先將小鼠放入反應(yīng)箱中適應(yīng)3min，然后暗室底部通以36V、50Hz的電流，將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室則受到電擊。24h后再次將小鼠放入明室，記錄5min內(nèi)進(jìn)入暗室的潛伏期。如果5min時小鼠仍未進(jìn)入暗室，則潛伏期記為300s。

1.4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)

2.結(jié)果

2.1脫氫表雄酮硫酸酯對記憶損傷小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)的影響

與空白組相比，模型組跳臺錯誤次數(shù)顯著增多（P<0.01，表1），跳臺潛伏期和避暗潛伏期均明顯縮短（P<0.01，表1）。與模型組相比，脫氫表雄酮硫酸酯（10、20mg·kg■，sc）預(yù)處理顯著減少錯誤次數(shù)（P<0.01，表1），延長跳臺潛伏期（P<0.01、P<0.05，表1）和避暗潛伏期（P<0.05，表1），此2個劑量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脫氫表雄酮硫酸酯對照組和溶劑對照組錯誤次數(shù)、跳臺潛伏期和避暗潛伏期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

脫氫表雄酮、脫氫表雄酮硫酸酯是人體循環(huán)內(nèi)主要的甾體激素，研究表明隨著年齡的增加在體內(nèi)的水平會逐漸減低，在年老的SD大鼠、C578L/6和SAM小鼠也發(fā)現(xiàn)與空白組相比脫氫表雄酮、脫氫表雄酮硫酸酯在海馬、皮層和小腦有明顯降低。它對腦有直接作用可對多種記憶損傷模型有記憶增強(qiáng)作用。地佐環(huán)平是NMDA受體拮抗劑，可以造成記憶力明顯減退，是很好的記憶損傷模型[3]，[4]。為了排除雌性小鼠動情周期對體內(nèi)甾體激素濃度的影響，故選用雄性小鼠作為研究對象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在被動逃避實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，地佐環(huán)平增加跳臺的錯誤次數(shù)，縮短跳臺潛伏期和避暗潛伏期，表明地佐環(huán)平造成記憶力下降。預(yù)先給予脫氫表雄酮硫酸酯（10、20mg·kg■，sc）能減少錯誤次數(shù)，延長跳臺潛伏期和避暗潛伏期，但2個劑量之間未見差異。

近年來大量文獻(xiàn)認(rèn)為，LTP是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞突觸模式，LTP的形成和維持需要NMDA受體的參與，動物實(shí)驗(yàn)研究顯示谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)通過激活NMDA受體對學(xué)習(xí)過程產(chǎn)生重要作用[5]。NMDA是NMDA受體的特異性配體，可以特異性激活NMDA受體，從而引起細(xì)胞外Ca■內(nèi)流，因此我們可以通過觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca■濃度判斷NMDA受體的功能。PC12細(xì)胞是一種從大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤分離的克隆細(xì)胞，神經(jīng)生長因子分化及未分化的PC12細(xì)胞上均存在豐富的NMDA受體，是研究神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體的良好模型。

脫氫表雄酮硫酸酯和孕烯醇酮硫酸酯等興奮性神經(jīng)甾體可以直接或間接的作用于NMDA受體[5]，許多急性實(shí)驗(yàn)也證明脫氫表雄酮硫酸酯可以提高NMDA受體的功能[6]。本實(shí)驗(yàn)通過100μmol·L■脫氫表雄酮硫酸酯預(yù)處理NMDA刺激的PC12細(xì)胞24h后，鈣離子濃度明顯增高，顯示出NMDA受體功能的增強(qiáng)，此實(shí)驗(yàn)非急性實(shí)驗(yàn)，極有可能基因效應(yīng)對受體發(fā)揮作用。由此推測脫氫表雄酮硫酸酯可能直接用于NMDA受體，引起NMDA受體數(shù)目上調(diào)，或者引起NMDA受體某亞基表達(dá)增加，或者通過其他途徑，間接對NMDA受體發(fā)揮作用，但最終結(jié)果均是提高NMDA受體的功能，這可能是脫氫表雄酮硫酸酯改善記憶的機(jī)制。

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