一氧化氮的發(fā)現(xiàn)歷程

摘 要：一氧化氮，曾經(jīng)的大氣污染物，現(xiàn)在是細(xì)胞間的信號(hào)分子；硝酸甘油，曾經(jīng)的炸藥，現(xiàn)在是心血管特效藥。這得益于三位美國(guó)藥理學(xué)家（Furchgott，Ignarro和Murad）的重大發(fā)現(xiàn)，他們因此獲得1998年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。回顧其發(fā)現(xiàn)歷程，不禁感嘆他們“讓實(shí)驗(yàn)說話”的精神和巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路。

關(guān)鍵詞：一氧化氮； 發(fā)現(xiàn)歷程； 硝酸甘油； EDRF

中圖分類號(hào)：G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-3315（2013）11-026-001

1.背景

1953年Furchgott發(fā)表首篇乙酰膽堿（ACh）致兔離體血管條收縮的論文，與當(dāng)時(shí)公認(rèn)的給動(dòng)物靜注ACh引起血管舒張的觀點(diǎn)相反。但因其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好且觀察無誤，他堅(jiān)持己見。

2.質(zhì)疑

1962年Jellife醫(yī)生發(fā)現(xiàn)并報(bào)道在血清素預(yù)收縮的血管環(huán)上，低濃度ACh導(dǎo)致其舒張，很高濃度ACh才使其收縮。遺憾的是此文章當(dāng)時(shí)并未引起重視，而ACh對(duì)非血管平滑肌收縮效應(yīng)已確定，致使ACh對(duì)離體動(dòng)脈血管作用存在悖論。長(zhǎng)達(dá)20年一直無人深究或?qū)urchgott觀點(diǎn)提出質(zhì)疑。直到1978年，F(xiàn)urchgott實(shí)驗(yàn)室的一次偶然事件才使這一矛盾得以澄清。

3.轉(zhuǎn)折

技術(shù)員David未按Furchgott的實(shí)驗(yàn)步驟操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬用于預(yù)收縮血管的CCh（ACh類似物）并不使兔主動(dòng)脈環(huán)收縮，相反使其舒張。他向Furchgott抱怨：一定是哪兒出了問題。

4.思考

Furchgott來到實(shí)驗(yàn)室仔細(xì)檢查了實(shí)驗(yàn)，他首先注意到David未按他寫明的加藥順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即在還未洗掉浴槽中去甲腎上腺素（NA）時(shí)就加入了CCh，這時(shí)血管環(huán)處于收縮狀態(tài)。同時(shí)他發(fā)現(xiàn)CCh確實(shí)總是引起收縮狀態(tài)的血管環(huán)舒張。于是他們一起檢查其原因：CCh被NA污染了？可重配的CCh仍使動(dòng)脈環(huán)舒張；用新配的ACh替代CCh加入浴槽，仍是舒張反應(yīng)。此時(shí)他注意到，以往實(shí)驗(yàn)用的是螺旋血管條標(biāo)本，而David采用的是易制備的主動(dòng)脈環(huán)。于是他們開始比較這兩種標(biāo)本制備是否會(huì)造成血管反應(yīng)性的差異。

把對(duì)ACh呈舒張反應(yīng)的血管環(huán)取出浴槽、剪成血管條，再掛入浴槽后加入ACh。Furchgott注意到標(biāo)本制備時(shí)干凈利落，一次就順利掛入浴槽的血管條都對(duì)ACh呈舒張反應(yīng)，而對(duì)ACh無舒張反應(yīng)的標(biāo)本是被反復(fù)操作使內(nèi)膜面受摩擦的血管條。這是他得到的第一個(gè)線索：內(nèi)膜摩擦可能導(dǎo)致血管失去對(duì)ACh的舒張反應(yīng)。

5.深入研究

他們又仔細(xì)檢查了螺旋血管條的制備方法。Furchgott又驚奇地發(fā)現(xiàn)，他們制備血管條過程中，血管內(nèi)膜面恰好一直搭在手指尖上，且為防止血管條卷曲，又通常是把剪下的血管條內(nèi)膜面朝下平鋪于濕潤(rùn)的濾紙上，再切成長(zhǎng)短適宜的血管條。他們立即改進(jìn)上述方法，不觸及內(nèi)膜面，發(fā)現(xiàn)血管條對(duì)ACh呈舒張反應(yīng)。他們把這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)年學(xué)術(shù)討論會(huì)上作了報(bào)告。這是首篇打破ACh悖論、接近于發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子（EDRF）的正式學(xué)術(shù)報(bào)告。

為什么動(dòng)脈血管內(nèi)膜面摩擦?xí)?dǎo)致其喪失對(duì)ACh的舒張反應(yīng)呢？雖然內(nèi)皮細(xì)胞被列入懷疑對(duì)象，但當(dāng)時(shí)他首先想到的是機(jī)械摩擦造成血管壁細(xì)胞損傷，損傷的細(xì)胞釋放某種酶，使血管平滑肌上“舒張”受體失活。于是他們又走了彎路。

6.小意外

一組織學(xué)家的工作險(xiǎn)些葬送了他們的發(fā)現(xiàn)：Furchgott將呈良好舒張反應(yīng)和摩擦后不舒張的兩種血管環(huán)標(biāo)本送到另一實(shí)驗(yàn)室做組織學(xué)檢查，送回來的兩種標(biāo)本都不含內(nèi)皮細(xì)胞，也就是說，這一結(jié)果已排除了內(nèi)皮細(xì)胞在舒張反應(yīng)中的必要。慶幸的是，半年后一新技術(shù)員改進(jìn)了組織染色方法，終于發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的有無是血管舒張與否的關(guān)鍵。1979年第二篇更接近EDRF的論文摘要投寄至美國(guó)藥理與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)會(huì)，該論文已明確提出血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管反應(yīng)性有關(guān)。

7.靈光一現(xiàn)

為什么刺激內(nèi)皮細(xì)胞可引起血管平滑肌舒張？Furchgott首先想到的是血管內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后釋放某物質(zhì)擴(kuò)散至平滑肌并導(dǎo)致其舒張。他回憶道：那天早晨我剛醒來，一個(gè)漂亮的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)突然闖入我的腦海。于是我來到實(shí)驗(yàn)室，立即按這一方案進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果便是1980年發(fā)表于Nature上的著名論文“內(nèi)皮細(xì)胞是ACh誘發(fā)動(dòng)脈平滑肌舒張的必需因素”。

“Sandwich”血管灌流實(shí)驗(yàn) 分四步觀察不同情況下兔主動(dòng)脈對(duì)ACh的反應(yīng)：

（1）正常血管環(huán)及與內(nèi)膜摩擦處理后的比較；

（2）正常血管環(huán)與膠原酶處理（化學(xué)損傷內(nèi)皮）后相比較；

（3）按照以下要求及順序?qū)嵤?shí)驗(yàn)：①橫血管條（與管壁平滑肌走向一致）并去內(nèi)皮；②縱血管條（與平滑肌垂直）含內(nèi)皮；③將①與②中血管條并列掛在同一個(gè)浴槽，內(nèi)膜面相近且相對(duì)；④第③實(shí)驗(yàn)完后立即移除②中血管條；

（4）正常血管環(huán)，通O2與通N2的比較。

其中（3）的精彩和（4）的出人意料使人印象頗深。（3）中方法是“三明治”血管灌流。（4）中結(jié)果明確內(nèi)皮細(xì)胞釋放EDRF需O2。

8.NO是EDRF的確證

1979年，Murad從牛動(dòng)脈血管上取出一塊活體進(jìn)行檢驗(yàn)，把按一定比例混合的NO和N2注入活體上。當(dāng)混合氣體通過光滑的肌肉時(shí)，肌肉舒張。此結(jié)果與硝酸甘油引起的反應(yīng)相同。硝酸甘油必須代謝為NO才能發(fā)揮舒張血管的作用。NO可能是一種對(duì)血流具有調(diào)節(jié)作用的信使分子。

當(dāng)時(shí)這一推測(cè)缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。1980年Furchgott發(fā)現(xiàn)了一種小分子自由基，能舒張血管平滑肌。幾年后，受Murad和Furchgott工作的啟發(fā)，Ignarro假想EDRF是NO。他利用光譜分析證明了這種假想的真實(shí)性并和Furchgott在1986年公布了這一發(fā)現(xiàn)。1987年Moncada等在觀察EDRF對(duì)血管平滑肌舒張作用的同時(shí)，用化學(xué)方法測(cè)定了內(nèi)皮細(xì)胞釋放的物質(zhì)為NO，并據(jù)其含量解釋了其對(duì)血管平滑肌舒張的程度。1988年P(guān)olmer等人證明精氨酸是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的前體，從而確立了哺乳動(dòng)物體內(nèi)可以合成NO。

自此，人們終于了解了硝酸甘油治療心絞痛的秘密，NO也開始了在生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)方面的廣泛應(yīng)用，為無數(shù)患者帶來希望。