攀西地區蠶豆根瘤菌抗逆性研究

摘要：對采自四川省攀西地區8個縣市14個采樣點的22株蠶豆根瘤菌進行耐鹽、耐酸堿、抗生素抗性和耐高溫或低溫等抗逆性測定，結果表明，供試菌株普遍耐鹽性差，僅有4株菌株能在10 g/L NaCl上生長，其中2株菌株能在50 g/L NaCl上生長；供試菌株對酸堿的耐性比較強，所有菌株都能在pH 5.0～10.0范圍內生長，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0范圍內生長；對溫度的適應范圍較寬，63.6%的菌株既能耐受8 ℃低溫，又能耐受60 ℃高溫熱激30 min；對抗生素的抗性表現為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環素>慶大霉素>卡那霉素。篩選出2株耐鹽、耐酸堿、生長溫度范圍廣和耐抗生素較強的菌株，分別為B1和B3。

關鍵詞：蠶豆根瘤菌；抗逆性；攀西地區

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2516-03

攀西地區位于長江上游，處川西南地區、橫斷山脈系，屬青藏高原、云貴高原向四川盆地的過渡帶，地勢西北高、東南低，相對高度5 653 m[1]。該地區光資源豐富，具有典型的南亞熱帶河谷氣候特征和山區立體氣候特點，境內不僅現有生物資源豐富，而且具有引種、培育熱帶和寒帶多種動植物的條件[2]。

蠶豆是世界上重要的豆科作物，是中國重要的糧食、蔬菜、副食、飼料、綠肥和養地作物[3]。四川栽培蠶豆有2 000多年的歷史，年種植蠶豆約30萬hm2[4]，其中涼山、阿壩、甘孜三州生產的大白蠶豆品質好，部分產品以原糧出口創匯，是高原山區的主要增收作物[5]。蠶豆共生體——根瘤菌能夠固定空氣中的氮合成氨，供植物生長需要，但其共生固氮受到環境條件的限制[6，7]，并有研究指出，某種特殊根瘤菌群的出現與適當的宿主豆科植物、土壤溫度、土壤酸堿度、土壤水分含量等有明顯的相關性[8]。研究對攀西地區8個縣市的14個采樣點分離的22株蠶豆根瘤菌進行耐鹽性、生長溫度、生長pH范圍以及對抗生素抗性的測定，為篩選適宜攀西地區環境的高效蠶豆根瘤菌及其遺傳多樣性的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從四川省攀西地區8個縣市14個采樣點分離得到22株蠶豆根瘤菌，水培回接全部結瘤，供試菌株情況見表1。

1.2 抗逆性試驗

1.2.1 耐鹽性測定 在YMA培養基上進行供試菌株的活化培養，后接種于NaCl濃度分別為10、20、30、40和50 g/L的YMA培養基上，以含0.2 g/L NaCl的YMA培養基為對照，重復3次，28 ℃培養7 d觀察記錄，生長記為“+”，不生長記為“-”。

1.2.2 耐酸堿性測定 以pH 7的YMA培養基為基礎培養基，用HCl或NaOH調節培養基pH分別為4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，然后將供試菌株接種于不同pH的培養基上，以pH 7.0的培養基為陽性對照，28 ℃培養7 d，觀察及記錄方法同1.2.1。

1.2.3 生長溫度范圍測定 將活化純化的菌株接種于YMA培養基上，分別在8、28、37和60 ℃（其中，37 ℃和60 ℃是指在此溫度下熱激處理30 min后于28 ℃下培養）下培養7 d，以28 ℃為陽性對照，觀察及記錄方法同1.2.1。

1.2.4 抗生素抗性測定 選取氨芐青霉素（Amp）、慶大霉素（Gm）、紅霉素（Em）、氯霉素（Cm）、四環素（Tc）和卡那霉素（Km）6種抗生素，每種抗生素終濃度分別設定為5、50、100、300 μg/mL 4個濃度梯度。每種抗生素經細菌過濾器過濾除菌后，加入到經高溫滅菌處理后冷卻至50 ℃左右的YMA培養基中，制成平板，以不加抗菌素的YMA平板為對照，培養觀察及記錄方法同1.2.1。

以上試驗均采用點接種法，每個處理設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 耐鹽性測定結果

供試的蠶豆根瘤菌對NaCl的耐性普遍較差，81.8%的菌株不能在含10～50 g/L NaCl的培養基上生長，僅有4株菌株能在含10 g/L NaCl的培養基上生長，分別為B1、B2、B3和B15，其中菌株B1、B3還能在試驗所設其他濃度（30～50 g/L）的含NaCl的培養基上生長，具有較好的耐鹽性。比王慶等[9]測得的蠶豆根瘤菌的耐鹽生長范圍0.1～0.3 mol/L（5.8～17.6 g/L）廣；刁治民等[10]對青海蠶豆根瘤菌進行耐鹽回接試驗表明，在營養液NaCl濃度為0.1 mol/L（5.8 g/L）時已經不結瘤；何恒斌等[11]對沙冬青根瘤菌進行的耐鹽試驗指出，在鹽漬化灘地采集到的根瘤菌能耐受70 g/L的NaCl。不同菌株耐鹽性差異可能與菌株生長的地理環境有關。

2.2 耐酸堿性測定結果

供試蠶豆根瘤菌對酸堿的耐性范圍較廣，不同的菌株對酸堿的耐性存在差異。試驗結果表明，所有供試菌株均能夠在pH 5.0～10.0的范圍內生長；除B5不能在低pH（pH 4.0）下生長，B4、B11、B12、B16、B17不能在pH 11.0和pH 12.0下生長， B19不能在pH 12.0下生長外，其他菌株（占菌株總數的68.2%）均能在pH 4.0～12.0的范圍內生長。

2.3 生長溫度范圍測定結果

溫度是重要的生態因子之一，影響固氮酶活性，針對蠶豆根瘤菌生長溫度范圍的測定還少見報道。徐開未等[12]對金沙河谷區山螞蝗屬根瘤菌進行溫度范圍測定結果表明，在4 ℃也有根瘤菌生長。一般認為根瘤菌的最適生長溫度為25～30 ℃，60 ℃高溫下5 min會全部被殺死，只有極少數根瘤菌能生長在4 ℃的條件下[13]。此次試驗供試蠶豆根瘤菌生長溫度范圍較廣。有81.8%的菌株能在8 ℃的條件下生長，全部菌株能在37 ℃熱激30 min處理后生長，77.3%的菌株能在60 ℃熱激30 min處理后生長。其中，B2不能在低溫（8 ℃）和高溫（60 ℃）熱激處理后生長，B4、B13、B16、B18不能在高溫熱激處理后生長，B7、B14、B17不能在低溫條件下生長。由此可知，有63.6%的菌株既能耐受8 ℃的低溫，又能耐受60 ℃的高溫熱激。試驗菌株具有較廣的生長溫度范圍可能與攀西地區南亞熱帶氣候以及高山所形成的垂直氣候分布有關。

2.4 抗生素抗性測定結果

2.4.1 卡那霉素 供試蠶豆根瘤菌對卡那霉素都很敏感，沒有一株根瘤菌能在設定的最低濃度的卡那霉素平板上生長。

2.4.2 慶大霉素 供試蠶豆根瘤菌對慶大霉素的抗性強于卡那霉素。有27.3%的菌株能在濃度為50 μg/mL的慶大霉素平板上生長，18.2%的菌株能在100 μg/mL的慶大霉素平板上生長，有1株菌株能在300 μg/mL的慶大霉素平板上生長。其中，B4、B6能在5～50 μg/mL的慶大霉素平板上生長，B12、B16、B17能在5～100 μg/mL的慶大霉素平板上生長，B19能在試驗所設的所有濃度（5～300 μg/mL）范圍內生長，對慶大霉素抗性最強。

2.4.3 四環素 供試菌株對四環素耐受能力較差。除B4、B11、B12、B16、B17和B19外，其他所有菌株均能在低濃度（5 μg/mL）四環素平板上生長，占到72.7%；僅有1株根瘤菌（B3）能在試驗所設的所有四環素濃度（5～300 μg/mL）范圍內生長，對四環素表現出了較強的抗性。

2.4.4 紅霉素 供試蠶豆根瘤菌對紅霉素的抗性強于前3種抗菌素。全部根瘤菌均能在5 μg/mL的紅霉素平板上生長，31.8%的菌株能在50 μg/mL紅霉素的平板上生長，13.6%的菌株能耐受100 μg/mL的紅霉素，僅1株菌株能耐受300 μg/mL的紅霉素。其中，B1能在試驗所設所有紅霉素濃度（5～300 μg/mL）范圍內生長，表現出了較強的抗性；B3、B15能在5～100 μg/mL的紅霉素平板上生長；B7、B19、B20、B21能在5～50 μg/mL的紅霉素平板上生長。

2.4.5 氯霉素 供試蠶豆菌株對氯霉素的抗性較強，所有菌株均能在5 μg/mL的氯霉素平板上生長，86.4%的菌株能在50 μg/mL的氯霉素平板上生長，72.7%的菌株能耐受100 μg/mL的氯霉素，僅1株菌株能耐受300 μg/mL的氯霉素。其中，B1、B12和B17耐受性較差，僅能在5 μg/mL氯霉素平板上生長；B2、B5和B20能在5～50 μg/mL的氯霉素下生長；B21能在試驗所設所有氯霉素濃度（5～300 μg/mL）范圍生長，耐受性最強；其他均能在5～100 μg/mL的氯霉素范圍內生長。

2.4.6 氨芐青霉素 供試蠶豆根瘤菌對氨芐青霉素最不敏感，表現出了較強的抗性。所有供試菌株均能夠在含5 μg/mL氨芐青霉素的平板上生長，95.5%的菌株（除B11外的所有菌株）能生長于含50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，77.3%的菌株（除B4、B11、B12和B17外的菌株）能夠耐受100 μg/mL的氨芐青霉素，在含300 μg/mL氨芐青霉素的平板上仍然有72.7%的菌株（另除B16外的菌株）能夠生長。B11對氨芐青霉素最敏感。

綜上可知，供試蠶豆根瘤菌對抗生素的抗性普遍表現為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環素>慶大霉素>卡那霉素，不同的菌株有不同的抗性，同一菌株對不同抗生素的抗性不同，對同一種抗生素，隨著濃度的增大抗性也越來越弱。此結果與徐開未等[14]、何恒斌等[11]的研究結果相一致。根瘤菌對抗菌素的抗性可以作為分群的指標之一。韋革宏等[15]對河南省采集的根瘤菌進行的抗菌素抗性試驗發現，在低濃度的抗生素中大多數根瘤菌都能生長，在300 μg/mL的紅霉素、卡那霉素、慶大霉素中沒有1株根瘤菌生長，僅有7株根瘤菌能在300 μg/mL的青霉素中生長。韋革宏等[16]對山東省根瘤菌抗菌素抗性研究結果表明，32%的菌株對300 μg/mL的青霉素具有耐性。可見，來自不同地理環境的根瘤菌對抗菌素的抗性存在差異。研究篩選出了針對不同抗菌素有較強抗性的菌株， B1、B3、B19、B21分別能在300 μg/mL的紅霉素、四環素、慶大霉素、氯霉素上生長，表現出了較強的抗性。

3 小結

對采自攀西地區8個縣市14個采樣點經水培驗證的22株蠶豆根瘤菌的4項抗逆性指標進行分析后得出，菌株對鹽的耐性普遍較差，只有4株（B1、B2、B3、B15）菌株能在含10 g/L NaCl的培養基中生長，但仍有2株菌株（B1、B3）能在高濃度（50 g/L）NaCl條件下生長。菌株具有較強的耐酸堿性，所有菌株都能在pH 5.0～10.0的范圍內生長，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0的范圍內生長。對于溫度的耐性也比較強，有63.6%的菌株能耐受8 ℃的低溫和60 ℃的高溫熱激（熱激30 min），可能是與該地區特殊的氣候條件有關。對抗生素的抗性表現為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環素>慶大霉素>卡那霉素，除卡那霉素外，均篩選出了能抗高濃度（300 μg/mL）抗生素的菌株。

所有的菌株中，B1、B3能耐受高濃度（50 g/L）的NaCl，能在pH 4.0～12.0范圍內生長，能耐受8 ℃的低溫和60 ℃的高溫熱激，B1菌株能夠在含300 μg/mL紅霉素的平板上生長，B3菌株能在300 μg/mL四環素條件下生長。因此，這2株菌株為篩選出來的抗逆性較強的優良菌株。

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