南海紅樹林內生真菌GX—3代謝產物研究

摘要：采用反復硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等分離純化南海紅樹林內生真菌GX-3的代謝產物，并通過理化常數測定和光譜分析鑒定其化學結構。結果表明，從南海紅樹林內生真菌GX-3的菌體中分離得到6個代謝產物。經波譜解析，分別為：環（苯丙-甘）二肽（1）、環（丙-亮）二肽（2）、Fusaric acid （3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、環（脯-亮）二肽（5）、環（甘-亮）二肽（6）。初步藥理活性顯示化合物1對口腔癌細胞KB、KBv200的抗腫瘤活性的LD50值分別為6.5和11.2 μmol/L。通過鑒定，所有化合物均系首次從南海紅樹林內生真菌GX-3中分離得到。

關鍵詞：紅樹林；內生真菌；代謝產物

中圖分類號：O629 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2558-04

海洋微生物資源由于具有可持續開發性，其活性物質生產不受天然資源難再生的限制，能通過發酵進行胞外生產，與現代微生物技術相結合，較容易實現工業化生產，特別是其生產不對環境造成危害，符合當今綠色化學發展的方向。而多數報道均顯示海洋真菌都與紅樹林有著緊密的聯系[1，2]，對紅樹林真菌生物活性物質的研究已成為海洋微生物資源開發利用，尋找天然藥物先導化合物的重要途徑。近十幾年來，已有學者對中國南海紅樹林內生真菌進行了系統的研究，并從中分離獲得了一系列結構新穎、藥理活性良好的海洋天然化合物[3-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

美國Varian公司的INOVA-500NB超導核磁共振譜儀、INOVA-300NB核磁共振儀、VG ZAB-HS雙聚焦質譜儀、Thermo DSQ電子轟擊電離質譜儀和Thermo MAT95XP高分辨質譜儀；北京泰克儀器有限公司的X-4數字顯示顯微熔點測定儀。所用試劑均為廣州化學試劑廠生產，化學純，溶劑經重蒸后使用；柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產的200～300目硅膠，硅膠H，薄層硅膠GF254。

1.2 菌種培養

紅樹林內生真菌GX-3采自中國香港，經鑒定為擬莖點霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大學化學與化學工程學院。發酵培養基為葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1 g/L、粗海鹽2 g/L、pH 7.0。500 mL三角瓶內裝培養基200 mL，1.25×105 Pa 滅菌15 min后接種100 mL，在25 ℃靜置培養30 d。分別收集發酵液和菌體。

1.3 提取與分離

100 mL發酵物過濾得菌體和發酵液，發酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠（200～300目）進行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進行梯度加壓洗脫。收集各組分再經反復柱層析，制備薄層層析，重結晶等方法進行純化。從菌體粗提物（約20 g）分離得到環（苯丙-甘）二肽（1）（6 mg）、環（丙-亮）二肽（2）（8 mg）、Fusaric acid （3）（10 mg）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）（5 mg）、環（脯-亮）二肽（5）（10 mg）、環（甘-亮）二肽（6）（10 mg）。

1.4 細胞毒活性試驗

采用MTT法[10]測定化合物1對人體口腔癌KB、KBv200的抗腫瘤活性。

1.5 化合物的試驗數據

2 結果與分析

化合物1～6的結構圖如圖1所示。

化合物1：白色粒狀晶體， FABMS顯示分子離子峰為205[M+1]+， NMR結合質譜，得到分子式為C11H12N2O2。1HNMR中，δ 8.07 （brs， 1H）和7.80 （brs，1H）表明存在2個酰胺質子信號；δ 7.27 （m，3H）和7.17（m，2H）提示存在單取代苯環；δ 4.05 （dd，8.0，5.0 Hz，1H）說明存在連接雜原子的-CH；δ 3.09（dd，13.5，4.5Hz，1H）和2.89 （dd，13.5，5.0Hz，1H） 是芐亞甲基的特征；δ 3.36 （dd，17.5，3.0Hz，1H）和2.80 （d，17.5Hz，1H） mg/L的偶合常數相同，說明是連接雜原子的-CH2的2個同碳質子。根據這些信息推出該化合物為環（甘-苯丙）二肽。進一步與標準譜圖及文獻[11]對比得到確證。

化合物2：白色粉末，IR（KBr）νmax1 679、1 648/cm提示分子中存在酰胺鍵， 2個活潑氫8.09（brs，1H）， 8.00（brs，1H）證實了酰胺基的存在。δ 3.99（q，7 Hz，1H） 和δ 3.93（dd，4.5，5.5 Hz，1H）分別為連在酰胺氮上的CH，分子中有3個甲基，其中一個裂分為兩重峰δ 1.44（d，7 Hz，3H），與δ 3.99的CH相連，另外2個也裂分為雙峰，與δ 1.64（m，1H）相連， 說明分子中存在異丙基結構。1HNMR譜中還剩下一個與δ 3.93的CH相連的CH2。根據NMR數據參照文獻[12]可確定其為環（丙-亮）二肽。

化合物3：無色晶體，薄層層析顯示有拖尾現象，可能推斷是羧酸類化合物。EIMS給出分子離子峰m/z 179，結合NMR數據分析推出分子式C10H13NO2，不飽和度為5。1HNMR中 2.7 （t，7.8 Hz，2H），1.6（m，7.8，7 Hz，2H），1.4（m，7.5，7 Hz，2H）， 0.9（t，7.5 Hz，3H） 幾組氫之間的偶合關系，表明分子中的CH3與3個CH2互相連接成一個丁基鏈，8.8（s，1H），8.2（d，8.1 Hz，1H）， 7.8 （d，8.1 Hz，1H）顯示分子中存在兩個鄰位芳香質子和一個孤立的芳香質子。13C NMR和 DEPT譜圖顯示10個碳，其中3個季C，3個CH，3個CH2， 1個CH3。除掉丁基鏈的4個碳外，剩余的6個碳的化學位移和類型分別為165.6 （C）、147.7（CH）、145.4（C）、143.2（C）、138.8（CH）、124.6 （CH），其中165.6（C）應為羧酸基團，其余5個碳同剩下的一個N對應4個不飽和度，可推測為吡啶環。綜合以上信息，可以推測該化合物為一個取代了一個丁基和一個羧酸的吡啶。對照文獻[13]，確定該化合物的結構為5-丁基-2吡啶甲酸，又名Fusaric acid。

化合物4：無色晶體，溶于甲醇。TLC碘缸顯色為泛白拖尾尖頭帶狀。EIMS顯示分子離子峰為258，結合核磁可得化合物C12H22N2O4。在13CNMR只顯示六組碳信號[161.5（C），65.8 （CH），36.3 （CH），25.8 （CH2），14.9 （CH3），12.2 （CH3）]，表明化合物存在對稱結構。參照文獻[14]，確定化合物的結構為3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione，該化合物也曾在黑曲霉真菌中被分離得到過。

化合物5：白色粉末固體，溶于常見溶劑。EIMS顯示分子離子峰為210，結合核磁數據可推出該化合物的分子式為：C11H18N2O2。13CNMR和DEPT譜顯示該化合物有3個CH，4個CH2和2個CH3，3個季碳（包括兩個羰基，δ 170.1，166.1），這樣可知分子中余下一個活潑氫，δ 6.52（brs，1H）處有一個活潑氫（NH）。分子的不飽和度為4， 除去已有的2個不飽和度，還剩2個不飽和度，說明分子中存在2個環，根據所得核磁數據與文獻[15]對照，基本一致，所以該化合物被確定為環（脯-亮）二肽。環（脯-亮）二肽有抗濾過性病原體、抗腫瘤的活性[16]。

化合物6：白色粉末，mp：224-226 ℃。EIMS顯示分子離子峰為170，再根據核磁數據推斷分子式為：C8H14N2O2，不飽和度為3，13CNMR和DEPT顯示1HNMR譜中有2個活潑氫信號（δ 8.20 7.91），它們可能是酰胺中的氫，δ 3.79 （1H，m）和3.63 （2H，m）分別是與N相連的CH和CH2。δ 0.89 （3H，d，J=6.9Hz）和0.87 （3H，d，J=6.9Hz）是裂分為雙重峰的2個甲基化學位移，δ 1.76 （1H，m）為次甲基CH，這些說明了分子中存在一個異丙基，13CNMR（DEPT）譜反映分子中有2個伯碳δ 22.0、23.1，2個仲碳

δ 42.1、44.2，2個叔碳δ 23.8、52.8，2個季碳δ 166.0（酮羰基）、168.3（酮羰基），不飽和度為3，說明該化合物應該有一個環。參照標準譜圖[17]，化合物6確定為環（甘-亮）二肽。

3 小結與討論

本試驗對南海紅樹林內生真菌GX-3代謝產物進行研究，從菌體中分離得到6個化合物：環（苯丙-甘）二肽（1）、環（丙-亮）二肽（2）、Fusaricacid（3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、環（脯-亮）二肽（5）、環（甘-亮）二肽（6）。初步藥理活性顯示化合物1對口腔癌細胞KB、KBv200抗腫瘤活性的LD50值分別為6.5和11.2 μmol/L。通過鑒定，所有化合物均系首次從南海紅樹林內生真菌GX-3中分離得到。

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