miR—182基因表達(dá)與肺癌的相關(guān)性的研究

[摘要] 目的 分析肺癌局部miR-182的表達(dá)水平，考察其與肺癌臨床特征的相關(guān)性。 方法 選取2012年3月～2013年5月在我科住院并行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者62例，分離腫瘤組織并提取miR-182，RTPCR方法檢測(cè)miR-182的表達(dá)水平，分析其肺癌臨床病例特征之間的相關(guān)性。 結(jié)果 miR-182在不同年齡和性別的患者中表達(dá)沒有差異（P>0.05）；miR-182在肺癌組織中的表達(dá)與浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性（P<0.01）。腺癌組織表達(dá)miR-182高于鱗癌組織，但其增加趨勢(shì)相同。 結(jié)論 腫瘤組織miR-182的表達(dá)水平與肺癌臨床特征具有一定的關(guān)聯(lián)性，并可用于肺癌的臨床診斷，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] miR-182；肺癌；RT-PCR；相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）30-0001-02

肺癌一直是全球死亡率最高的癌癥，而我國(guó)居民的肺癌死亡率從20世紀(jì)70年代中期到90年代初期增加了1.5倍，是患者數(shù)量增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤[1]。肺癌中80%左右為非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）[2]，臨床上一般將鱗形細(xì)胞癌、未分化癌、腺癌劃分為NSCLC。目前研究報(bào)道m(xù)iR-182在肺癌的發(fā)病中發(fā)揮了一定的作用，但其機(jī)制尚不明確[3]。本文旨在通過檢測(cè)miR-182在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)，明確miR-182是否可作為非小細(xì)胞肺癌的分類分型和預(yù)后分析的關(guān)鍵標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

選取2012年3月～至2013年5月在我科住院并行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者62例，所有患者術(shù)前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療，每例患者均取材包括腫瘤組織及癌旁組織，癌旁組織經(jīng)HE染色鑒定為正常組織，組織標(biāo)本離體后 10 min 內(nèi)于液氮中迅速冷凍后置-80℃保存。每例樣本均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷證實(shí)。

62例患者中男41例，女21例，年齡44～78歲，平均（63.3±12.7）歲；肺癌分型主要包括：鱗癌32例，腺癌30例；患者腫瘤分期根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期[4]。鱗癌和腺癌比較研究中，從鱗癌和腺癌患者中均隨機(jī)抽取20例患者，兩組患者在年齡、性別、癌癥程度上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

1.2 試劑

miRCute miRNA提取分離試劑盒、Real Master Mix Probe試劑盒（天根公司），5×Reverse Tanscriptase M-MLV Buffer，dNTP Mixture（大連寶生物公司），引物和探針均由上海閃晶公司設(shè)計(jì)并合成。miR-182、U6上游引物購(gòu)至上海生工生物工程有限公司。

1.3 RT-PCR

組織中總 RNA 提取：取-80 ℃ 保存的組織，切成薄片，用液氮研磨法磨成粉末，用天根公司miRCute miRNA 提取分離試劑盒（離心柱型） 按說明書操作提取總 miRNA。用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 溶液 A260/280 nm比值，計(jì)算 RNA 濃度和純度，取A260/280 nm比值在1.8～2.1者用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄后，加入miR-182或內(nèi)參U6探針等，置于熒光定量PCR上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以 2-△△Ct方法計(jì)算miR-182的相對(duì)表達(dá)量[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行，計(jì)量資料采用（x±s）表示，兩兩均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182在肺癌組織中的表達(dá)

肺癌患者中年齡≥60和年齡<60歲miR-182的表達(dá)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；肺癌男女患者之間miR-182沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；miR-182在肺癌組織中的表達(dá)與浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性（P<0.01）。見表1。

表1 miR-182在肺癌組織中的表達(dá)[（x±s），n=62]

注：年齡、性別統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)，浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期采用單因素方差分析

2.2 miR-182在不同類型肺癌中的表達(dá)

肺癌腺癌組織中miR-182表達(dá)均高于鱗癌組織中表達(dá)水平（P<0.01），通過腫瘤分期數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，伴隨腫瘤的惡化，miR-182在兩種腫瘤變化趨勢(shì)基本相同。見表2。

表2 miR-182在不同類型肺癌中的表達(dá)[（x±s）n=20]

注：與鱗癌比較，*P<0.5，**P<0.01

3 討論

MicroRNA（miRNA），即微小RNA，是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核糖核苷酸（nt）、分布于非編碼區(qū)的小分子非編碼RNA[6]。研究人員推測(cè)miRNA與特定的mRNA結(jié)合后能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，作為負(fù)調(diào)控子有效地抑制蛋白質(zhì)翻譯，還有部分miRNA甚至可以使mRNA降解，對(duì)生物機(jī)體的發(fā)育和各個(gè)生理過程可能均具有調(diào)控作用。據(jù)研究報(bào)道，大約50%的miRNA基因位于與腫瘤相關(guān)的染色體擴(kuò)增或者缺失部位， miRNA與腫瘤之間密不可分的關(guān)系，miRNAs 在人類的多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，可能是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，比如miRNAs具有調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞增殖以及非接觸抑制生長(zhǎng)的特性[6]。傳統(tǒng)研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由一系列致癌基因和抑癌基因突變逐步形成的，隨著非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)，表明非編碼RNA中的成員microRNA對(duì)腫瘤形成起重要的調(diào)控作用。各種腫瘤中miRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，可能起致癌或抑癌基因作用。miRNA與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，考察miRNA與肺癌的相關(guān)性對(duì)于肺癌的診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)發(fā)揮重要作用。

肺癌位居世界癌癥死因之首， 肺癌的發(fā)生也是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。大多數(shù)肺癌均起源于支氣管粘膜上皮， 主要包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌四種基本類型。研究表明，has-miR-155的高表達(dá)和has-let-7a-2的低表達(dá)可能會(huì)降低肺腺癌患者的存活率[7]。還有研究人員對(duì)112個(gè)NSCLC病患的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)has-miR-221和has-let-7a對(duì)于肺癌患者具有保護(hù)作用，而has-miR-137、has-miR-372、has-miR-182則會(huì)對(duì)預(yù)后有不良的影響[8]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的與肺癌關(guān)系比較密切的miRNA有miRNA-126、miRNA-221、miRNA-222、has-miR-221、miR-17-92簇、miRNA-128b 、has-miR-137、has-miR-182、has-miR-372及miRNA-let7家族成員等[9]。

目前，關(guān)于 miR-182 在惡性腫瘤中的表達(dá)及其發(fā)揮的作用尚不明了，甚至有矛盾之處。miR-182通過下調(diào)腫瘤調(diào)控基因BRCA1的表達(dá)來影響DNA的修復(fù)，進(jìn)而影響乳腺癌的治療。而有研究顯示，miR-182 高表達(dá)的ER+乳腺癌患者，對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，無復(fù)發(fā)，生存期長(zhǎng)，且 miR-182 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于miR-182 在不同的腫瘤中靶基因可能并不完全相同，而其下游靶基因的生物學(xué)效應(yīng)決定了miR-182 的作用[10]。同時(shí)miR-182 在腫瘤中檢測(cè)結(jié)果不一致的原因也可能是由于miRNA 的表達(dá)具有時(shí)序性、組織特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-182可顯著表達(dá)于肺癌患者腫瘤部位，其表達(dá)量在患者年齡和性別之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而伴隨著肺癌的發(fā)展，浸潤(rùn)程度（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）的發(fā)生，miR-182的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，癌癥分期水平越高而miR-182表達(dá)量也逐步增加，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表達(dá)miR-182在肺癌中的表達(dá)扮演了一個(gè)負(fù)面的作用，這與運(yùn)用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸對(duì)157 個(gè)miRNA 表達(dá)進(jìn)行分析has-mir-182 是危險(xiǎn)性的miRNA取得的結(jié)果相似，其可能與在乳腺癌中扮演同樣的機(jī)制，通過調(diào)控基因BRCA1的表達(dá)來影響DNA的修復(fù)，進(jìn)而影響肺癌的進(jìn)程，亦有文獻(xiàn)報(bào)道將mir-182前體has-mir-182轉(zhuǎn)染入低侵襲性的肺癌細(xì)胞系中，肺癌細(xì)胞系滲入基質(zhì)膠膜的侵襲性增強(qiáng)，肺癌患者miR-182表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。此外，肺癌鱗癌和腺癌中miR-182表達(dá)量雖有不同，但其不同分期癌癥表達(dá)趨勢(shì)相同，這可能與不同類型肺癌的組織細(xì)胞的敏感性有關(guān)。

綜上述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-182在肺癌患者組織中表達(dá)水平上調(diào)，且與肺癌臨床病理特征密切相關(guān)，局部組織的miR-182有可能成為新一代的肺癌腫瘤標(biāo)志物，并可用于肺癌的臨床診斷，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2013-05-29）