過氧化物酶Ⅰ在正常和骨關節炎膝關節軟骨組織中的表達

[摘要] 目的 探討過氧化物酶Ⅰ在正常和骨關節炎膝關節軟骨組織中的表達。 方法 選取本院2010年10月～2012年10月行單側膝關節表面置換術的骨關節炎患者39例為觀察組，選取本院同期行單側膝關節表面置換術的非骨關節炎患者26例為對照組，分別提取部分膝關節軟骨，采用Western Blot方法檢測膝關節軟骨組織細胞中過氧化物酶Ⅰ的表達水平。 結果 觀察組平均積分光度值明顯高于對照組，觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的氧化物酶Ⅰ免疫組化染色的平均積分光度值均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的氧化物酶Ⅰ免疫組化染色的平均積分光度值呈增加趨勢，相互間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的氧化物酶Ⅰ免疫組化染色的平均積分光度值呈現明顯的增加趨勢，相互間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。 結論 骨關節炎膝關節軟骨組織中過氧化物酶Ⅰ的表達水平顯著高于正常膝關節軟骨組織中過氧化物酶Ⅰ的表達水平。

[關鍵詞] 過氧化物酶Ⅰ；骨關節炎；膝關節；軟骨組織；表達

[中圖分類號] R684 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）32-0063-03

Expression of PrxⅠin normal and OA cartilage tissues of knee joint

WU Chao

Second Department of Surgery， Urumqi Petroleum Chemical General Factory Worker Hospital， Urumqi 830019， China

[Abstract] Objective To investigate expression of PrxⅠin normal and OA cartilage tissue of knee joint. Methods A total of 39 OA patients who treated knee arthroplasty were selected in hospital from October 2010 to October 2012 as observation group. 26 non-OA patients who treated knee arthroplasty were selected in hospital at the same period as control group. Part of knee joint cartilage were extracted. Expression of PrxⅠin cartilage tissue cells of knee joint was detected by Western blot method. Results Average integral absorbance value in observation group was significantly higher than control group. Average integral absorbance values of knee joint cartilage surface， middle， deep in observation group were significantly higher than control group. Difference was statistically significant （P < 0.05）. Average integral absorbance values of knee joint cartilage surface， middle， deep in control group showed increasing trend，while there was no significant difference among （P > 0.05）. Average integral absorbance values of knee joint cartilage surface， middle， deep in observation group showed significant increasing trend，while difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Expression of PrxⅠin OA cartilage tissue of knee joint is significantly higher than that in normal cartilage tissue of knee joint.

[Key words] PrxⅠ； OA； Knee joint； Cartilage； Expression

骨關節炎（OA）是臨床常見的一種骨科疾病[1]，其典型的病理特征為軟骨發生進行性退變或潰瘍，影響關節的正常生理功能。OA多伴有軟骨表層的活性氧歧化物與凋亡細胞的大量聚集，不利于軟骨缺損與潰瘍病灶的修復[2]。有研究表明，OA患者病灶位置的軟骨組織中過氧化物酶的表達水平顯著高于正常人群[3]。過氧化物酶Ⅰ（PrxⅠ）是臨床常見的一種活性氧歧化物清除劑，參與機體的多種生理功能，對于平衡機體的微環境具有重要意義[4-6]。為了探討PrxⅠ在正常和OA膝關節軟骨組織中的表達，本院選取2010年10月～2012年10月行單側膝關節表面置換術的OA患者39例與同期行膝關節表面置換術的非OA患者26例進行對比研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2010年10月～2012年10月行單側膝關節表面置換術的OA患者39例為觀察組，年齡47～69歲，平均（58.3±7.2）歲，男15例，女24例，其中左側19例，右側20例，手術時間72～136 min，平均（93.1±27.5）min，術后隨訪3個月。患者均符合OA的診斷標準，排除患有心肺疾病、肝腎疾病、血液病、精神病患者。本院同期行單側膝關節表面置換術的非OA患者26例為對照組，年齡35～70歲，平均（56.1±10.4）歲，男10例，女16例，其中左側13例，右側13例，手術時間78～134 min，平均（91.8±26.7）min，術后隨訪3個月。排除患有膝關節疼痛病史和軟骨疾病的患者。手術原因：車禍傷21例、摔倒傷5例。兩組患者的基礎資料（年齡、性別、患側、手術時間、隨訪時間等）比較，差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。此次研究患者知情同意，經醫院倫理委員會通過。

1.2 方法

膝關節表面置換術中取得軟骨組織先用PBS液沖洗2次，將其剪成不足1 mm3的小塊，置于含有0.1%透明質酸酶與0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM液中，于37℃震蕩消化4 h，然后通過100目的細胞篩，用500 rpm離心收獲細胞，用PBS液沖洗，離心備用。取適量的裂解液，加入苯甲基磺酰氟，使濃度達到1 mmol/L，數分鐘后取樣品的軟骨細胞5×105個左右，放入到150 μL的裂解液中，使用移液槍吹打，讓細胞和裂解液充分混合，2 s后細胞將會裂解，在4℃下用10 000 rpm離心5 min，取上清液，使用BCA法可測定蛋白濃度。稱取30 μg蛋白質放入到5倍上樣緩沖液中，煮沸5 min，變性后，進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳，待溴酚藍到達凝膠底部時，給予90 V電壓，持續60 min，再將蛋白質移到PVDF膜，使用含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液在室溫下封閉60 min，于4℃下孵育一抗并過夜，一抗為鼠抗人（1∶500稀釋）。給予樣品TBST緩沖液沖洗10 min，反復沖洗3次，使用羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000稀釋）在室溫下孵育60 min，給予樣品TBST緩沖液沖洗10 min，反復沖洗3次，使用ECL化學發光法檢測并記錄顯影結果。切取軟骨，使用4%多聚甲醛固定48 h，再使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，實施3 μm的厚度行組織切片，放到涂有APES的載玻片上，給予切片脫蠟和水化處理，使用3%的雙氧水甲醛液孵育15 min，使用PBS液沖洗3 min，反復沖洗3次，在室溫下給予山羊血清封閉30 min，去掉血清，使用1∶150的過氧化物酶Ⅰ多克隆抗體在4℃下孵育一抗并過夜，使用PBS液沖洗3 min，反復沖洗3次，放入辣根過氧化物酶標記的二抗在37℃下進行結合30 min，使用PBS液沖洗3 min，反復沖洗3次，加入DAB顯色45 s，水洗后使用蘇木素染色，封片使用顯微鏡采集圖像，如果細胞內存在棕黃色染色顆粒可判定為過氧化物酶Ⅰ蛋白表達為陽性，否則為陰性。使用美國Image-Pro Plus v15.0專業的分析軟件進行圖像分析，對免疫組化染色為陽性的細胞進行過氧化物酶Ⅰ的定量分析，計算陽性染色的平均積分光度值=積分光密度/測量區域面積。

1.3 統計學處理

所有數據資料均采用SPSS16.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用F檢驗和t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值比較

兩組患者PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值分析顯示（表1），觀察組平均積分光度值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。

表1 兩組患者PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值比較（x±s）

2.2 兩組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值比較

兩組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值分析顯示（表2），觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

表2 兩組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值（OD值）比較（x±s）

2.3 兩組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值分析

對照組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值分析顯示（表3），對照組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值呈現出增加趨勢，相互間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。觀察組患者膝關節軟骨組織不同深度PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值分析顯示（表3），觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值呈現出明顯的增加趨勢，相互間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

OA是臨床常見的一種慢性關節疾病[7]，其主要特點為關節軟骨會發生退行性病變或繼發性骨質增生，會給患者帶來很多疼痛，嚴重影響患者的正常生活，大幅降低患者的生活質量。隨著人口老齡化的發展和身體機能的逐漸減弱，老年人成為了OA的高發人群[8]，且患者中女性多于男性，首先的發病位置多為負重較大的部位，如膝關節、髖關節、脊柱及手指關節等處。對于OA的治療，目前尚無統一的定式，由于關節軟骨的缺損不能自我修復且會呈現持續性進展，及早治療是改善患者預后的關鍵。

Li等[9]和Serena等[10]研究表明，關節軟骨細胞的凋亡在OA進展過程中起著重要作用，大量細胞凋亡會造成周圍軟骨基質的快速增加，使得機體軟骨的基質合成與基質降解發生失衡，出現負平衡，進而加速關節軟骨發生退變的速度。由于關節軟骨細胞凋亡后會直接附著于軟骨的表層，在表層會呈現出大量的聚集現象，使得細胞凋亡過程呈現出分布趨向性，會大幅減少關節軟骨缺損病灶周圍的正常細胞數量，損傷病灶周圍對關節缺損的修復潛能，造成機體喪失自我修復的能力。同時活性氧歧化物也會呈現分布趨勢性，大量分布于軟骨表層，是造成軟骨表層細胞發生氧自由基損傷的主要原因，最終可引發軟骨細胞凋亡。

PrxⅠ是Prx家族中重要的成員之一，廣泛存在于機體的細胞之中，是一種強效的抗氧化劑，可有效清除機體的活性氧歧化物，良好維持細胞的內穩態，減弱或消除細胞發生損傷和凋亡，具有重要的臨床價值。正常情況下PrxⅠ在軟骨組織內外的分布是均一的，而發生OA后軟骨組織表面的活性氧歧化物會大幅增加，誘導機體生成更多的PrxⅠ去清除活性氧歧化物，由于活性氧歧化物大多位于軟骨組織的表層，需要消耗更多的PrxⅠ，會造成表層的PrxⅠ表達水平低于深層的PrxⅠ表達水平的現象。由于機體的差異性，PrxⅠ的表達水平也不同，在不同的層間分布中也存在差異，如何在患者的軟骨表層進行聚集和凋亡目前尚無法解釋，需進一步進行研究。

本研究表明，觀察組平均積分光度值明顯高于對照組，說明OA患者的膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達水平顯著升高。觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的氧化物酶Ⅰ免疫組化染色的平均積分光度值均明顯高于對照組，說明OA患者的膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達水平呈現出了全方位的升高態勢。對照組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值呈現出增加趨勢，說明正常人群的膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達是比較均一的。觀察組膝關節軟骨組織表層、中層、深層的PrxⅠ免疫組化染色的平均積分光度值呈現出明顯的增加趨勢，說明OA患者的膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達隨著病癥的發展會越來越高，越到軟骨組織的深層，PrxⅠ的表達越明顯。

綜上所述，OA膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達水平顯著高于正常膝關節軟骨組織中PrxⅠ的表達水平。

[參考文獻]

[1] Roberta R，Mariagrazia L，Valentina M，et al. Serological markers of erosive hand osteoarthritis[J]. European Journal of Internal Medicine，2013，24（1）：11-15.

[2] Shen CL，Brenda JS，Lo DF，et al. Dietary polyphenols and mechanisms of osteoarthritis[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry，2012，23（11）：1367-1377.

[3] 周亞鵬，史占軍，肖軍，等. 過氧化物酶Ⅰ在骨關節炎軟骨組織中的表達與分布及意義[J]. 中華關節外科雜志（電子版），2012，6（2）：268-273.

[4] Chen MF，Lee KD，Yeh CH，et al. Role of peroxiredoxin Ⅰ in rectal cancer and related to p53 status[J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2010，78（3）：868-878.

[5] 葛麗華，侯敏，楊晶，等. 抗氧化蛋白Prx1在口腔黏膜白斑中的表達[J]. 北京口腔醫學，2012，20（3）：135-137.

[6] 康瑞霞，劉霞西，劉蕓，等. Prx1對細胞信號轉導過程的調控[J]. 現代生物醫學進展，2012，12（11）：2186-2190.

[7] Wendy MJ，Carol G，Derek R. The effect of osteopathic manual therapy on the vascular supply to the lower extremity in individuals with knee osteoarthritis： A randomized trial[J]. International Journal of Osteopathic Medicine，2012，15（4）：125-133.

[8] Kim J，Xu M，Xo R，et al. Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J]. Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[9] Li QQ，Peng SQ，Sheng ZG，et al. Ofloxacin induces oxidative damage to joint chondrocytes of juvenile rabbits： Excessive production of reactive oxygen species， lipid peroxidation and DNA damage[J]. European Journal of Pharmacology，2010，626（2-3）：146-153.

[10] Serena B，Claudia C，Gaetana T，et al. Biomarkers of oxidation， inflammation and cartilage degradation in osteoarthritis patients undergoing sulfur-based spa therapies[J]. Clinical Biochemistry，2010，43（12）：973-978.

（收稿日期：2013-07-26）