349例乳腺癌HER—2基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)相關(guān)性研究

[摘要] 目的 了解乳腺癌組織中人表皮生長因子受體2（HER-2）基因擴(kuò)增與Her-2/neu蛋白表達(dá)的一致性與相關(guān)性。方法 采用熒光原位雜交（FISH）法及免疫組化（IHC）法分別檢測349例浸潤性乳腺癌患者的HER-2基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)情況，分析二者檢測結(jié)果的一致性與相關(guān)性。 結(jié)果FISH與IHC符合率為55.3 %，結(jié)果存在一致性（Kappa=0.189，P=0.000），呈正相關(guān)（r=0.434，P=0.000）。 結(jié)論 FISH與IHC兩種檢測結(jié)果存在一致性，但I(xiàn)HC（+～+++）患者均應(yīng)以FISH檢測作為評價HER-2基因是否擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；人表皮生長因子受體-2；熒光原位雜交；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）20-16-03

人表皮生長因子受體-2（HER-2）基因擴(kuò)增與蛋白的過度表達(dá)提示該患者的內(nèi)分泌治療效果差，而應(yīng)用曲妥珠單抗敏感性好[1-2]。目前指導(dǎo)臨床治療的常規(guī)檢測方法為免疫組織化學(xué)（IHC）法和熒光原位雜交（FISH）法。本資料主要探討IHC法HER-2蛋白表達(dá)與FISH法HER-2基因擴(kuò)增的一致性與相關(guān)性，為臨床應(yīng)用曲妥珠單抗等藥物提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年11月～2013年3月在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科及2010年10月～2012年11月在四川省德陽市人民醫(yī)院病理科進(jìn)行IHC與FISH檢測的349例患者，石蠟切片分別用于IHC與FISH檢測。

1.2 試劑與探針

IHC檢測使用基因科技（上海）有限公司抗體，ER克隆號：SP1；PR克隆號：SP2：erbB-2多克隆抗體；Ki-67克隆號：MIB-I.FISH，檢測使用北京金普嘉公司HER-2基因擴(kuò)增試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC技術(shù) 采用免疫組化envision法進(jìn)行檢測，Her-2蛋白棕色陽性定位于細(xì)胞膜。

1.3.2 FISH技術(shù) 按北京金普嘉公司Her-2基因擴(kuò)增試劑盒說明書操作：（1）標(biāo)本要求：2年以內(nèi)的浸潤性乳腺癌患者的石蠟包埋組織切片。新鮮標(biāo)本取下后1h內(nèi)放入10%中性福爾馬林固定，用量為組織塊的10倍以上，固定時間為6～48h；（2）老化玻片：切片厚3μm，置于干凈的涂膠玻片，65℃烘烤過夜。（3）切片處理：常規(guī)脫蠟復(fù)水；高壓鍋抗原修復(fù)3min，冷卻4min；37℃ 2×SSC液5min漂洗兩次；37℃胃蛋白酶溶液（5μg/mL）+0.01mol/L HCL消化10～18min；37℃ 2×SSC液漂洗5min兩次；乙醇梯度脫水后自然干燥玻片。（4）變性雜交：滴加10μL探針混合液覆蓋組織，封片膠封閉蓋玻片，于雜交儀中83℃變性8min，42℃雜交16h。（5）洗滌、判讀：取出切片后去除封片膠，室溫下于2×SSC液中浸泡使蓋玻片自然脫落；46℃ 2×SSC漂洗10min；46℃ 0.1% NP40漂洗5min；室溫70%乙醇浸泡4min；暗處自然干燥玻片后加10μL DAPI覆蓋雜交區(qū)域并蓋上蓋玻片，暗處放置10～20min后熒光顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 IHC結(jié)果判定 無著色者為（﹣）；任何比例的浸潤癌細(xì)胞呈微弱、不完整的細(xì)胞膜著色者為（+）；>10%的浸潤癌細(xì)胞呈微弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻的細(xì)胞膜棕黃著色者，或<30%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐著色；>30%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜棕褐著色者為（+++）[3]。

1.4.2 FISH結(jié)果判定 （1）浸潤癌區(qū)腫瘤細(xì)胞Her-2紅信號明顯成簇成團(tuán)，判定為簇狀擴(kuò)增；（2）若不同于（1）的情況，計(jì)數(shù)30個細(xì)胞并計(jì)算Her-2紅信號與著絲粒綠信號之比值，Ratio<1.8為陰性；Ratio>2.2為陽性；Ratio介于1.8～2.2之間時，增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100，若比值仍不變則判斷為不確定[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件分析，兩種方法檢測結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

IHC與FISH檢測Her-2狀態(tài)結(jié)果比較349例浸潤性乳腺癌患者的病理標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測HER-2基因擴(kuò)增率為28.08%（98/349）。5例病理標(biāo)本重復(fù)制片并擴(kuò)大計(jì)數(shù)后Ratio介于1.8～2.2之間，判定結(jié)果為可疑，2例2007年及2例2008年病理標(biāo)本結(jié)果無法判讀。IHC檢測結(jié)果以陽性為主，Her-2/neu蛋白陽性（++～+++）率為69.91%（244/349）。IHC檢測結(jié)果為（﹣/+）的病例中FISH檢測擴(kuò)增率為4.76%（5/105），IHC（++）的病例中擴(kuò)增率為29.59%（50/169），IHC（+++）的病例中擴(kuò)增率為57.33%（43/75）。一致性檢驗(yàn)顯示FISH與IHC一致率為55.3%，結(jié)果存在一致性（Kappa=0.189，P=0.000），兩種檢查結(jié)果呈正相關(guān)（r=0.434，P=0.000）。見表1。

3 討論

針對乳腺癌的臨床用藥篩選，首先應(yīng)對乳腺癌標(biāo)本的ER、PR、HER-2、Ki-67等蛋白表達(dá)進(jìn)行常規(guī)免疫組化檢測。作為乳腺癌的靶向治療篩選，HER-2的FISH檢測不可替代。HER-2高表達(dá)或其基因的擴(kuò)增與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療等有著重要的聯(lián)系[5-6]。HER-2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對內(nèi)分泌治療及常規(guī)化療藥物不敏感、預(yù)后差，而對HER-2的靶向藥物曲妥珠單抗的敏感性較好。曲妥珠單抗已通過美國FDA認(rèn)證[7]，但必須由IHC（+++）時或FISH法檢測結(jié)果為基因擴(kuò)增時才能使用[8]。

本研究中，349例浸潤性乳腺癌標(biāo)本的FISH檢測結(jié)果顯示HER-2基因擴(kuò)增率為28.08%（98/349），與某些國外報道基本一致[9-10]。IHC檢測HER-2蛋白狀態(tài)為（-/+）時，F(xiàn)ISH檢測HER-2基因擴(kuò)增率為4.76%（5/105），兩者符合性較好，與大多數(shù)文獻(xiàn)報道一致[4，11]，提示IHC（-/+）時也應(yīng)進(jìn)一步行FISH檢測進(jìn)行篩查，避免遺漏部分HER-2蛋白狀態(tài)為（-/+）但其HER-2基因擴(kuò)增者的治療；IHC（++）時的FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增率為29.59%（50/169），與Heba AL-Khattabi[12]、李慧慧等[13]的報道相近，顯示IHC（++）者應(yīng)常規(guī)進(jìn)行FISH檢測，才能更加準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床選擇治療方案；IHC（+++）時FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增率為57.33%（43/75），低于CM Ellis等[14]（90.0%）、Ghaffari等[11]（93.9%）、杜江等[15]（68.8%）的報道，此結(jié)果也是造成FISH與IHC相對符合率（55.3%）較低的主要原因，這最有可能與本次檢測IHC（+++）的標(biāo)本量較少（75例）有關(guān)，也不排除IHC本身的特點(diǎn)，如標(biāo)本固定﹑抗原修復(fù)、抗體差異、操作技術(shù)及主觀判讀等因素的影響。本檢測結(jié)果通過一致性檢驗(yàn)顯示FISH與IHC檢測結(jié)果存在一致性，且呈正相關(guān)，與Kovács等[4]報道的一致，但其程度不及上述者，差異主要存在于IHC（+++）的情況。目前國內(nèi)外推薦的用藥篩選標(biāo)準(zhǔn)是先行IHC檢測，若IHC（+++）者可直接進(jìn)行靶向治療。但從本次結(jié)果來看，IHC（+++）者有較大比率的HER-2基因無擴(kuò)增。基于Mass等[16]報道了應(yīng)用曲妥珠單抗治療799例HER-2蛋白表達(dá)狀態(tài)為（++）或（+++），但HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)不同的浸潤性乳腺癌患者，結(jié)果顯示有78%（596/765例）HER-2基因擴(kuò)增患者應(yīng)用曲妥珠單抗治療的總有效率及長期生存率高于無基因擴(kuò)增22%（169/765例）患者，可能提示IHC（+++）者再行FISH檢測呈擴(kuò)增者的預(yù)后將為更好。也有較多研究者支持應(yīng)由FISH檢測結(jié)果作為判斷能否應(yīng)用曲妥珠單抗治療及預(yù)后的基本標(biāo)準(zhǔn)[11]，因此建議不論IHC（++）或（+++）者均應(yīng)該進(jìn)一步行FISH檢測，一來可判斷HER-2基因是否擴(kuò)增，二來可預(yù)知即使是IHC（+++）者的預(yù)后情況。

總之，IHC（+～+++）乳腺癌患者的常規(guī)ER、PR、Her-2/neu、Ki-67免疫組化結(jié)果，可初步提供臨床的治療方案、預(yù)后判斷及HER-2基因擴(kuò)增等情況，但仍應(yīng)以FISH檢測方法作為評價HER-2基因是否擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。

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（收稿日期：2013-08-16）