LC—MS/MS測定甲磺酸伊馬替尼中的伊馬胺

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-質譜聯用測定甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質伊馬胺的方法。 方法 選用C18色譜柱（3.5μm，150mm×3.0mm），以0.05%甲酸的乙腈-20mmol/L甲酸銨為流動相，采用梯度洗脫進行分離，流速：0.5mL/min；柱溫為40℃；進樣量10μL。對照品溶液選用TSQ Quantum Ultra質譜儀的選擇離子檢測（SIM）掃描方式進行檢測。 結果 該方法在2.5～100.0ng/mL范圍內線性良好（0.998），定量限和檢出限分別為2.5ng/mL和1.0ng/mL，方法回收率97.1%，穩定性較好。 結論 本研究所建立的方法快速、靈敏、專屬性強，適用于甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質伊馬胺的測定。

[關鍵詞] 甲磺酸伊馬替尼；LC-MS/MS；基因毒性雜質；伊馬胺

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）20-36-03

甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate）是瑞士Novartis公司研發的Bcr-Abl酪氨酸激酶受體抑制劑，2001年首次在美國上市[1]，商品名Gleevec。臨床主要用于治療慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）急變期[2-3]、加速期或α-干擾素治療失敗后的慢性期患者和治療不能切除和發生轉移的惡性胃腸道間質腫瘤（GIST）的成人患者[4]，治療效果得到了廣泛的認可。伊馬胺化學名N-（5-氨基-2-甲基苯基）-4-（3-吡啶基）-2-嘧啶胺是合成甲磺酸伊馬替尼合成的中間體[5-7]，屬于潛在的基因毒性雜質[8-9]。根據美國食品和藥物管理局（FDA）和國際藥品注冊協調會議（ICH）關于基因毒性雜質的指導原則要求[10-11]，本資料擬建立采用LC-MS/MS測定本品合成中間體伊馬胺的含量方法。

1 儀器與試劑

儀器：XS105電子分析天平（瑞士METTLER公司）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；TSQ Quantum Ultra三重四級桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（美國Thermo Scientific公司）。

試劑：甲酸（色譜純，Fluka公司）；乙腈（色譜純，Fisher公司）；甲酸胺（色譜純，上海安譜科學儀器公司）；超純水（屈臣氏）；伊馬胺（含量99.7%，本公司自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

色譜條件：照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄ⅤD），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲酸銨緩沖液（取甲酸銨1.26g，加水1000mL溶解后，用甲酸調節pH值至3.4～3.5）為流動相A，含有0.05%甲酸的乙腈為流動相B；流速為0.5mL/min，梯度洗脫程序t：0-6-10-15-15.1-25min，流動相比例B%：20%-20%-80%-80%-20%-20%，柱溫為40℃，進樣量為10μL。

質譜條件：電噴霧（ESI）電離源，正離子方式檢測；噴霧電壓：3.0kV；氣化溫度：300℃；鞘氣（N2）壓力：30arb；輔助氣（N2）壓力：5arb；離子傳輸管溫度：300℃；掃描方式為選擇離子檢測（SIM），用于定量分析的檢測離子為m/z：277.8。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取甲磺酸伊馬替尼適量，精密稱定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀釋制成每毫升中約含5mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液 取伊馬胺對照品約25mg，精密稱定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀釋成每毫升中約含500ng的溶液搖勻，作為對照品儲備溶液。

2.3 分析方法確證

2.3.1 質譜分析 將對照品溶液采用蠕動泵進樣模式，進行全掃描（full scan）形式分析檢測，相應的質譜圖見圖1。

胺對照品溶液的選擇離子掃描質譜圖

2.3.2 方法的專屬性 在所確定的2.1色譜-質譜條件下，對空白溶液（水-乙腈=70︰30）和伊馬胺對照溶液100ng/mL，）進行檢測，考察方法的專屬性，色譜圖見圖2。結果表明：在2.1色譜-質譜條件下，空白溶液不干擾伊馬胺雜質的檢測，專屬性良好。

2.3.3 線性關系考察 精密量取伊馬胺對照品儲備液0.25、0.5、1、5、10mL置50mL量瓶中，用稀釋液稀釋定容至刻度，分別配制成濃度為2.5、5、10、50、100ng/mL的溶液，精密量取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜質譜儀中，采用2.1確定的色譜-質譜條件檢測，記錄色譜圖，量取峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，線性回歸方程為：A=146470600×C-221088，r=0.998，說明本品在2.5～10ng/mL范圍內線性良好。測定結果見下表1。

2.3.4 定量限與檢測限 在2.3.3試驗條件下，配制不同濃度伊馬胺對照品，檢測限以S/N≥3計，定量限以S/N≥10計，分別進樣確定伊馬胺的檢測限和定量限，實驗結果見下表2。

2.3.5 方法準確度 稱取甲磺酸伊馬替尼約125mg，置25mL量瓶中，作為回收率基質樣品；稱取伊馬胺約25mg，置50mL的量瓶中，用水-乙腈（70︰30）溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，精密量取該溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀釋至刻度，精密量取該溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀釋至刻度作為伊馬胺雜質溶液。以伊馬胺的含量（0.0002%基質樣品濃度）為基準100%，分別精密量取伊馬胺雜質溶液2.5、5.0、10.0mL分別置于盛有基質樣品的25mL量瓶中，混勻，用水-乙腈（70︰30）稀釋定容，配制成含伊馬胺雜質50%、100%、200%的溶液，同法平行3次，作為供試品溶液。

精密量取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜質譜儀中，采用2.1確定的色譜-質譜條件檢測，記錄色譜圖，量取峰面積（其中供試品中伊馬胺的峰面積需扣除樣品基質中伊馬胺的峰面積），計算回收率，實驗結果見表3。

從上述系列表可以看出，伊馬胺測定平均回收率為97.1%，RSD為3.75%（n=9），表明該方法檢測伊馬胺的準確度很好。

3 結論

采用LC-MS/MS法測定藥物中的基因毒性雜質具有選擇性好，靈敏度高的優點，目前正越來越多的應用于新藥研發中遺傳毒性雜質的分析中[12-14]。基于伊馬胺為甲磺酸伊馬替尼為合成中間體同時也是潛在的降解產物，該雜質可能具有基因毒性含量低（小于2ppm），因而對其檢測方法提出了更高的要求。應用單一的HPLC方法[15]，采用紫外檢測器最低的檢測限度為20ppm，而采用液質聯用技術，以選擇

離子檢測（SIM）監測方式掃描檢測，具有極高的靈敏度，最低檢測限度可達到0.2ppm，該檢測方法簡單、快速、方法靈敏度和準確度高，實用性強，為相關的藥品檢測工作提供了快速準確的技術支持，可為藥品安全，保證人體健康提供技術保障。

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（收稿日期：2013-07-12）