近紅外光譜法快速測定異煙肼片

[摘要] 目的 研究近紅外光譜法在異煙肼片快速測定中的應用。 方法 應用偏最小二乘法建立計算模型，通過方差分析法選擇計算波長，主成分分析法選擇驗證集和訓練集，交互驗證法選擇適當的計算因子數。 結果 應用所建立的偏最小二乘法模型，對9份異煙肼片測定異煙肼含量，與HPLC法相比，所測結果相對誤差≤±0.8%，方法準確可靠。結論 可將近紅外光譜法應用于異煙肼的快速測定，在異煙肼生產中的過程控制和快速質量檢測上有較大應用前景。

[關鍵詞]近紅外光譜；偏最小二乘法；異煙肼；含量測定

[中圖分類號] R945 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）20-88-03

美國FDA共批準了10種治療結核的藥物，異煙肼就是4種最核心的一線治療藥物之一，異煙肼對結核桿菌有抑制和殺滅作用，其生物膜穿透性好，由于療效佳、毒性小、價廉、口服方便，故被列為首選抗結核藥；異煙肼也是第一個抗抑郁藥物，但因為較強的肝臟毒性而退出市場；異煙肼對結核分枝桿菌有高度選擇性，抗菌作用強，目前測定異煙肼含量的方法主要有間接分光光度法[1]、極譜法[2]、高效液相色譜法[1、3-4]、伏安法[5-6]、化學發光法[7-10]等，但這些方法操作復雜、費時較長且常需要大量試劑。近紅外光譜技術（NIR）是近年迅速發展起來的綠色分析技術，利用近紅外光譜技術分析樣品具有方便、快速、高效、準確和成本較低，不破壞樣品，不消耗化學試劑，不污染環境等優點，因此該技術受到越來越多人的青睞[11-12]，可廣泛用于藥品的理化分析。近紅外光譜由于吸收強度弱，吸收峰重疊嚴重，因此必須將光譜進行數學方法處理后，才能對被測物質進行分析[13]。偏最小二乘法（PLS）能有效地降維，并消除自變量間可能存在的復共線關系，明顯改善數據結果的可靠性和準確度。本文應用近紅外光譜法對異煙肼片中異煙肼含量進行了定量分析。

1 儀器與試劑

紫外可見近紅外分光光度計（UV-3150，SHIMADZU Corporation，Japan），附件ISR-3100積分球，高效液相色譜儀（LC-2010，SHIMADZU Corporation，Japan），投入式恒溫水槽（NTT-2200P，RIKAKIKAI公司，Japan），Nucleosil C18（4.6mm×150mm，10μm）色譜柱（江申分離科技公司，大連）。

異煙肼片購于成都錦華藥業有限公司，異煙肼對照品購于中國藥品生物制品檢定所，原料藥購于浙江江北藥業有限公司；淀粉、蔗糖、糊精、羧甲基纖維素等輔料購于成都市泰山薄膜包衣有限公司，均符合中國藥典2005年版規定。甲醇為色譜純，其余試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 制備樣品

按照約0.5%的間隔，在異煙肼80%～100%的含量范圍內，將異煙肼和相關輔料賦形劑混合制成樣品共計41份，此外將9個批次的異煙肼片用研磨器研成粉末。分別按文獻[4]測定異煙肼片含量作為真實值。

2.2 光譜測量條件

在波長1200～2500nm范圍，設置狹峰為12nm，掃描速度設為慢，以BaSO4為空白掃描3次，以其平均光譜譜值作為各樣品的光譜。由于溫度會對樣品光譜測定產生較大的影響，因此本實驗的光譜數據在測定時均保持在熱水循環恒溫裝置控制溫度為（25±0.1）℃下。

2.3 數據處理

運用偏最小二乘法（PLS）軟件建立模型，以訓練集均方根誤差（RMSEC）、交互驗證均方根誤差（RMSECV）、預測集均方根誤差（RMSEP）和交互驗證中計算值與真實值回歸的相關系數（R）作為評價模型的指標。其計算方法見文獻[14]。

3 結果

3.1 近紅外光譜

異煙肼近紅外光譜譜圖如圖1所示，異煙肼在近紅外區域峰形較為復雜，吸收較弱。為進行數據分析，我們采用方差分析法選擇合適的光譜區間，計算50份樣品在各個波長下的相對標準偏差（RSD），以波長為橫坐標、以RSD為縱坐標作曲線如圖2。根據RSD形成的峰和谷將光譜分成圖2所示的6段。

3.2 驗證集的選擇

在50份樣品中選擇其中13份作為驗證集，其余37份作為訓練集。作樣品近紅外光譜的第一、二主成分得分圖如圖3，可見異煙肼的第一主成分占解釋變量的79.18%，第二主成分占16.85%。為使計算模型更穩健，訓練集和驗證集具有代表性，所選擇的預測集樣品必須均勻分布在主成分得分圖中。

3.3 最佳光譜區間的選擇

我們在構建模型時，為了避免將過多冗余信息引入，從而減弱光譜受各種非目標因素的影響，我們盡可能將無關信息的變量去除，提高了所構建模型的分辨率、靈敏度和運算效率，選擇的光譜區域均與組分性質相關性較強。以RMSECV、RMSEC、RMSEP和R四項指標為綜合評價指標，分別考察了不同波長對模型的影響，計算結果見表1。如表1所示，在1323～1540nm和1200～2500nm的全波長范圍，R值相對較高，RMSE值均相對較低，但RMSECV1323～1540nm波長下明顯小于全波長，全波長R值也較1323～1540nm下小，綜合考慮，我們選擇了1323～1540nm為所構建模型的計算波長。

3.4 最佳因子數的確定

使用PLS法建立校正模型，使用主成分數（又稱因子數）的選擇直接關系到模型的實際預測能力。如果使用主成分數（又稱因子數）過多，則會將一些反映噪音的信息也摻入計算，降低模型的預測能力，若建立模型使用的主成分數（又稱因子數）過少，則不能充分反映樣品的光譜信息。本文利用交互驗證法計算得到的PRESS及RMSECV值來確定最佳因子數，PRESS和RMSECV的值越小，表明建立的數學模型預測能力越好。因子數和PRESS、RMSECV的相關性圖見圖4，如圖所示，最佳因子數為5。

3.5 最佳模型建立與樣品測定

選擇因子數為5，以1323～1540nm為模型計算波長，建立最佳校正模型，以HPLC法分析結果作為真值，相對近紅外預測值作圖（圖5），所建模型R為0.99537，RMSEC為0.00451，RMSEP為0.00578。利用所建立模型測定9份異煙肼片中異煙肼含量，并與HPLC法測定值比較，結果列于表2，由表2所知，NIRS法與HPLC法所測值的相對誤差不大于0.796%，預測結果準確。

4 討論

本文應用近紅外光譜，通過偏最小二乘法測定了異煙肼片中異煙肼的含量，與高效液相色譜法（HPLC）相比，測定結果相對誤差<±0.8%，方法準確。近紅外光譜分析技術在近幾十年內得到了快速的發展而且在多個應用領域得到了廣泛的認可，它的魅力在于其可以在很短的時間內無需復雜的樣品制備過程即可完成物質成份多組分的同步快速定量分析，并且可以給出很高的分析精度，不產生任何化學污染且分析成本很低，易于在實驗室尤其是工業現場或在線分析領域得到推廣使用。如果將近紅外光譜轉化成數字化光譜，利用適宜的數字化近紅外光譜建立的定量模型為解決所收集的海量近紅外光譜光譜的分類、管理和再利用提供了新的思路。

近紅外光譜分析技術能夠以無損的方式從樣本中直接獲取分析信息，借助化學計量學方法對其譜圖特征分類、鑒別及質量控制進行研究，對于藥材的定性鑒別、質量控制具有十分重要的科學意義和實用價值。加上便攜式近紅外光譜儀的研制，近紅外光譜在快速、高效、無損分析方面將有很大的優勢。

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（收稿日期：2013-08-30）