Klotho基因多態(tài)性與衰老的相關(guān)性研究

[摘要] 目的 研究Klotho基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群衰老的關(guān)系。 方法 在482例（<60歲236例，60歲246例）沈陽(yáng)地區(qū)健康漢族人群，采用Snapshot（微測(cè)序） 的方法檢測(cè)Klotho基因標(biāo)簽SNP（TagSNP）-rs571118位點(diǎn)和功能SNP位點(diǎn)rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）的基因型，觀察Klotho基因多態(tài)性與衰老的關(guān)系。結(jié)果 證實(shí)在中國(guó)漢族人群F352V（rs9536314）為G純合子，C370S（rs9527025）為T(mén)純合子；rs571118位點(diǎn)存在AA，GG，AG基因型。老年人群基因型分布為（AA35（14.22），AG132（53.65），GG79（32.11）），年輕人群基因型分布為（AA51（21.61），AG128（54.23），GG57（24.15））。Klotho基因rs571118位點(diǎn)G等位基因頻率在老年人群高于年輕人群。結(jié)論 Klotho基因rs571118位點(diǎn)多態(tài)性與衰老存在明顯相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 衰老；Klotho基因；單核苷酸多態(tài)性

[中圖分類號(hào)] R394 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）10-09-03

遺傳因素在衰老中起到重要作用[1]，而基因是遺傳信息的載體和遺傳物質(zhì)的最小功能單位。衰老學(xué)家們認(rèn)為，衰老并非單一基因決定，而是一連串基因激活和阻抑及各自產(chǎn)物相互作用的結(jié)果。內(nèi)、外環(huán)境，如氧自由基等損傷因素都可以影響DNA（特別是線粒體DNA）的穩(wěn)定性，加速衰老進(jìn)程。衰老時(shí)人體機(jī)能下降，對(duì)疾病的易感性增強(qiáng)。而基因多態(tài)性位點(diǎn)的變化，可能影響基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。弄清衰老基因的功能、調(diào)控、影響因素可能是弄清衰老機(jī)制的一條重要途徑。Klotho是一種抗衰老基因。Klotho作為一種輔助因子/復(fù)合受體調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）23信號(hào)，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路包括p53/p21，cAMP，蛋白激酶C（PKC）和Wnt信號(hào)通路。Klotho保護(hù)內(nèi)皮的機(jī)能障礙和調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生，Klotho基因表達(dá)增加，能通過(guò)

抑制胰島素信號(hào)和氧化應(yīng)激進(jìn)而抑制衰老和延長(zhǎng)壽命[2]。人類Klotho基因的多態(tài)性相關(guān)于多種衰老相關(guān)疾病和紊亂的易感性增加。在1187白種人的研究中發(fā)現(xiàn)，在啟動(dòng)子區(qū)域（G-395A）和一個(gè)外顯子4（C1818T，）的單倍型和老年絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)密度顯著相關(guān)[3]，在韓國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，年齡差異影響Klotho G-395A和C1818T多態(tài)性與CAD的關(guān)聯(lián)性[4]。本研究對(duì)Klotho基因基因多態(tài)性與沈陽(yáng)地區(qū)中國(guó)健康漢族人群衰老的的關(guān)系進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年10月～2009年5月志愿者，男669例和女684例，經(jīng)過(guò)查體，詢問(wèn)病史、血尿常規(guī)、血生化、胸片、腹部超聲、心血管超聲、肺功能的檢查，篩查出482例“健康”志愿者，均為沈陽(yáng)市漢族居民，其中男228例，女254例，年齡35～91歲。

1.2 主要儀器和試劑

-80℃冰箱（SANYO Japan）；高速低溫離心機(jī)（Sigma USA）；ABI 3730xl DNA測(cè)序儀（ABI USA）；凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)Chemi Imager 5500（Alpha Innotech USA）。

1.3 方法

1.3.1 血標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象抽取清晨空腹外周靜脈血3 mL，2000 rpm離心15 min，棄上清，取血凝塊儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 基因組DNA的提取 取血凝塊，使用天根RelaxGene Blood DNA System血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取基因DNA，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.3 Klotho基因SNP位點(diǎn)的選取 在Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Klotho基因的中國(guó)漢族人群的SNP基因型和等位基因數(shù)據(jù)，用Haploview軟件進(jìn)行分析選擇tagSNP rs571118位點(diǎn)和兩個(gè)功能SNP位點(diǎn)rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）。選定SNP位點(diǎn)后，首先用30個(gè)DNA樣品進(jìn)行基因型分析，SNP位點(diǎn)雜合度大于5%則進(jìn)行大樣本的基因型鑒定。

1.3.4 Snapshot檢測(cè)及測(cè)序 使用Snapshot（ABI）試劑盒進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。反應(yīng)體系：3μL Snapshot mix；2μL延伸引物以；l μL純化的PCR產(chǎn)物。循環(huán)參數(shù)：96℃預(yù)變性1 min，96℃變性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)。微測(cè)序產(chǎn)物中加入1U SAP，37℃孵育60 min，75℃再孵育15 min，進(jìn)行純化處理，去除多余的引物和ddNTP。

每份樣品加入甲酰胺9μL，0.25μL內(nèi)標(biāo)Lizl20（ABI）和純化的微測(cè)序產(chǎn)物 1μL，95℃變性5 min后迅速放在冰上淬火2 min，在ABI的PRISMR3730xl DNA測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，運(yùn)行GeneMarker V1.6分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

30個(gè)DNA樣品分型后后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)功能SNP位點(diǎn)rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）為純合子。放棄進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行檢測(cè)，而rs571118位點(diǎn)存在存在AA，GG，AG基因型。

Klotho基因的rs571118位點(diǎn)衰老與對(duì)照組的基因型及基因頻率相比較，見(jiàn)表1。衰老組的各個(gè)基因型與年輕組相比存在差異（x2=4.48，P=0.034<0.05）；等位基因頻率在兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=5.73，P=0.016，OR=1.364，95%CI：1.058～1.760）。

3 討論

Klotho基因（MIM：604824）位于染色體13q12，包含5個(gè)外顯子，跨越近50 kb的基因組DNA，是一個(gè)衰老抑制基因[5]。過(guò)表達(dá)Klotho小鼠壽命延長(zhǎng)；當(dāng)敲除Klotho后，小鼠（klotho-/-）表現(xiàn)出諸多衰老相關(guān)的表型，如壽命縮短、不育、動(dòng)脈粥樣硬化、皮膚萎縮、肺氣腫、步態(tài)障礙、異位鈣化、骨質(zhì)減少/骨質(zhì)疏松癥、肺氣腫、腦垂體異常和異常的鈣代謝[6]。在人群為基礎(chǔ)的相關(guān)性研究中，Klotho基因也相關(guān)于一些衰老的表型如骨質(zhì)減少/骨質(zhì)疏松，動(dòng)脈硬化和鈣異常[2]。意大利的Chianti研究發(fā)現(xiàn)Klotho濃度是社區(qū)居住的老年人死亡率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[7]。Klotho基因和衰老相關(guān)通路insulin/IGF-1信號(hào)通路相關(guān)，它可能通過(guò)對(duì)于氧化應(yīng)激的抵抗而實(shí)現(xiàn)延遲衰老的功能[8]。Klotho作為一個(gè)輔因子增加Klotho纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFR）復(fù)合體結(jié)合到FGF23的結(jié)合力[9]。

Klotho基因的以KL-VS（F352V（rs9536314）和（C370S（rs9527025））位點(diǎn)為代表性的一些SNP位點(diǎn)受到廣泛研究。在意大利中北部，對(duì)總共1089名（669名女性和420名男性）從19～109歲無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體進(jìn)行的研究，將研究對(duì)象劃分為3個(gè)年齡段-年輕組、老年組和百歲老人組。比較Klotho基因KL-VS等位基因頻率，Klotho的雜合子基因型在老人與青年對(duì)照組相比有顯著的增加，而百歲老人和青年組之間無(wú)明顯差異[10]。在英國(guó)982名白種健康女性的研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)-395 G–A，1110 G–A，1818 C–T，2298 C–T和白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度不相關(guān)[11]。在韓國(guó)的的心血管病患者中觀察Klotho G-395A 和C1818T不同的多態(tài)表型對(duì)衰老的影響。同一位點(diǎn)在不同研究的結(jié)果不同也說(shuō)明了人種和種族的差別對(duì)于基因頻率有較大影響。

為了探討Klotho基因多態(tài)性在衰老中所起到的潛在的作用，排除一些干擾因素如腫瘤，一些衰老相關(guān)的疾病和其他疾病的影響。在本研究中我們應(yīng)用tagSNP策略選擇了Klotho基因的tagSNP位點(diǎn)rs571118進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Klotho基因rs571118位點(diǎn)G等位基因頻率在老年人群高于年輕人群。本研究提示Klotho基因rs571118位點(diǎn)可能和中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)漢族健康人群的衰老相關(guān)聯(lián)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kenyon CJ.The genetics of ageing [J].Nature，2010，464（7288）：504-512.

[2] Hu MC，Shiizaki K，Kuro-o M，et al.Fibroblast Growth Factor 23 and Klotho：Physiology and Pathophysiology of an Endocrine Network of Mineral Metabolism[J].Physiology，2013，75（1）：50，33.

[3] Kawano KI，Ogata N，Chiano M，et al.Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women[J].Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（10）：1744-1751.

[4] Rhee E-J，Oh K-W，Lee W-Y，et al.The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease[J].Metabolism： clinical and experimental，2006，55（10）：1344.

[5] Manolis AS.Klotho，Spinning the Thread of Life：an Anti-Ageing Gene[J].Hospital Chronicles，2012，7（3）：129-132.

[6] Chen T-H，Kuro-o M，Chen C-H，et al.The secreted Klotho protein restores phosphate retention and suppresses accelerated aging in Klotho mutant mice[J].European journal of pharmacology，2012，698（1-3）：67-73.

[7] Hu MC，Shi M，Zhang J，et al.Klotho deficiency causes vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology[J].2011，22（1）：124-136.

[8] Semba RD，Cappola AR，Sun K，et al.Plasma klotho and mortality risk in older community-dwelling adults[J]. The Journals of Gerontology Series A：Biological Sciences and Medical Sciences，2011，66（7）：794-800.

[9] Papaconstantinou J.Insulin/IGF-1 and ROS signaling pathway cross-talk in aging and longevity determination[J].Molecular and cellular endocrinology，2009，299（1）：89-100.

[10] Invidia L，Salvioli S，Altilia S，et al.The frequency of Klotho KL-VS polymorphism in a large Italian population，from young subjects to centenarians，suggests the presence of specific time windows for its effect[J].Biogerontology，2010，11（1）：67-73.

[11] Zhang F，Kato BS，Gardner JP，et al.Lack of association between leukocyte telomere length and genetic variants in two ageing-related candidate genes[J].Mechanisms of ageing and development，2007， 128（7）：415-422.

（收稿日期：2013-03-14）