P.f多期多表位基因真核表達載體的構建和免疫學特性初步研究

[摘要] 目的 構建惡性瘧原蟲多期多表位基因的真核表達載體及其免疫學特性的研究。方法 在前期研究基礎上，將測序正確的惡性瘧原蟲多期多表位基因克隆入真核表達載體VR1020內并大量制備。以VR1020重組質粒免疫HHD-2小鼠并進行細胞和體液免疫分析。結果 成功獲得重組真核表達載體，ELISA顯示該重組質粒免疫小鼠后獲得了較高效價的抗體，而且顯示了較好的CTL殺傷活性，同時誘導了高水平的細胞因子。結論 本研究為新型瘧疾疫苗的研制奠定一定的理論和實踐基礎。

[關鍵詞] 惡性瘧原蟲；疫苗；多表位基因

[中圖分類號] R392.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）10-26-03

瘧疾是嚴重危害人類健康的熱帶傳染病，在非洲僅次于HIV/AIDS，排在第2位。瘧疾疫苗的研制對兒童、孕婦等高危人群的保護方面尤為重要。但是，由于瘧原蟲具有復雜的生活史、抗原變異等特點，疫苗的研制仍是困難重重。目前已經結束Ⅲ期臨床試驗的RTS，S疫苗對低齡嬰兒的保護率僅為53%左右[1-2]，但這已經是瘧疾疫苗研究領域非常重大的突破。在瘧原蟲的生活史過程中，子孢子入侵肝細胞和裂殖子入侵紅細胞是兩個有決定性意義的步驟，截止目前尚無一種疫苗或疫苗免疫策略可成功兼顧瘧原蟲紅細胞內期和肝細胞內期。我們在前期構建瘧原蟲聯合紅內期和肝內期的多表位基因的基礎上，構建其真核表達載體并且研究其誘導小鼠的免疫應答。本研究從體液免疫和細胞免疫水平研究該多期多表位疫苗的免疫學特性，為研究新型瘧疾疫苗提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料

DNA免疫用載體質粒VR1020由美國海軍醫學研究所

的Stephen L.Hoffman博士惠贈。T-AMA-1和T-MEG均為本教研室制備，HHD-2小鼠由本教研室轉基因動物室提供。

1.2 方法

1.2.1 VR1020/AMAMEG重組表達載體的構建 采用參考文獻[3]方法，用BamHI和BgLII雙酶切的真核載體VR1020，以BamHI和NdeI雙酶切T-AMA-1，以NdeI和BgLII雙酶切T-MEG，將三片段用T4DNA連接酶連接，轉化DH5α。重組質粒VR1020 /AMAMEG采用雙酶切鑒定，并送TaKaRa公司進行核苷酸序列測定。

1.2.2 VR1020/AMAMEG重組質粒的大量制備 將重組質粒VR1020/AMAMEG陽性克隆接種于卡那抗性的LB培養基中，37℃，220 rpm震蕩12 h，次日1∶1000比例稀釋到100 mL卡那抗性的LB培養基中，37℃，220 rpm震蕩培養12 h，離心收集菌體，大提質粒試劑盒提取VR1020/AMAMEG質粒。

1.2.3 VR1020/AMAMEG重組免疫小鼠 每組5只，免疫前用0.75%戊巴比妥鈉75 mg/kg腹腔麻醉。于0周，3周，6周免疫3次，每只小鼠DNA免疫量為100μg，多點肌肉注射。

1.2.4 ELISA檢測抗體效價 應用文獻[4]方法，簡言之：用純化的AMA融合蛋白作為包被抗原，0.1μg每孔，待檢血清1∶100稀釋后每孔加入100 μL，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入1∶10000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1 h；PBS洗5次，加入TMB顯色，加入2M硫酸50μL/孔終止顯色，OD490處測吸光度。

1.2.5 細胞因子的誘生及其測定 用RPMI-1640完全培養液將各組免疫小鼠脾細胞調整至5×106/mL，加入24孔板中培養，800 μL/孔，分別加入MEGAMA純化蛋白10 μg/孔，對照組不加蛋白；置5% CO2孵箱中37℃培養42 h，收集培養液，5000 rpm離心5 min，取上清，-20℃凍存備檢；IFN-γ及IL-2含量的測定，參照試劑盒說明書進行（夾心ELISA法）。

1.2.6 CTL殺傷實驗 免疫小鼠后第12周分離免疫小鼠脾臟淋巴細胞，調整細胞濃度為1×107個/mL，置于96孔培養板中用RPMI 1640完全培養基培養，加入MEGAMA純化蛋白至終濃度為10 μmol/L，繼續培養2 d，作為效應細胞；C1R-AD細胞作為靶細胞。按不同的效靶比進行CTL殺傷實驗，乳酸脫氫酶實驗檢測CTL的細胞毒活性，并按下面的公式計算殺傷率：細胞殺傷率=（實驗組平均A值-自然釋放對照組平均A值）/（最大釋放對照組平均A值-自然釋放對照組平均A值）×100%。

2 結果

2.1 VR1020 /AMAMEG重組載體的酶切鑒定

經BamHI和BgLII雙酶切VR1020 /AMAMEG，得到1400 bp左右的片段（圖1），與預期片段大小一致，測序分析顯示序列與原始設計序列完全一致。

M-2000bp DNA標志物；1-VR1020/AMAMEG雙酶切

2.2 VR1020 /AMAMEG免疫小鼠后抗體效價

將VR1020 /AMAMEG免疫HHD-2小鼠，ELISA測定抗血清效價在免疫6周時上升較高，到9周時達到高峰。見圖2。

2.3 VR1020 /AMAMEG免疫后細胞因子誘生情況

結果見圖3A，B所示，重組DNA疫苗組和VR1020對照組IFN-γ和IL-2水平均高于對照組（P<0.01），且重組DNA疫苗免疫組高于VR1020空載體組（P<0.05）；提示重組DNA疫苗能夠誘導有效的細胞免疫應答。

2.4 VR1020 /AMAMEG免疫后誘導CTL殺傷情況

結果見圖4所示，重組DNA疫苗組的平均殺傷活性達到46.9%，VR1020組和生理鹽水組分別為18.4%和8.6%。重組DNA疫苗誘導的CTL活性在效靶比為100∶1時達到最高，為72.3%，顯著高于生理鹽水組（8.8%）和VR1020組（19.05%）。

3 討論

本研究基于多期多表位的重組瘧疾DNA疫苗構建和免疫學特性研究，以VR1020作為載體，以改造隱性表位為基礎的多串聯的CTL表位基因和瘧原蟲頂端膜抗原AMA-1作為目標基因片段構建重組真核表達載體。VR1020載體具有CMV的立即早期增強子/啟動子復合體，在啟動子與編碼序列之間插入了CMV立即早期基因的第一個內含子Intron A，來自人組織凝血酶原激活物（TPA）的信號肽序列位于多克隆位點的5’端，可引導目的蛋白進行分泌表達，而且該載體是美國FDA批準的少數可以用于人體的真核表達載體之一，目前用于較多的DNA疫苗研制中[5-6]。從實驗結果上看是能夠誘導較高水平的抗體產生，也能夠活化IL-2等的細胞因子，以及誘導CTL來殺傷相應靶細胞。該重組惡性瘧原蟲多期多表位真核表達載體免疫小鼠免疫學特性研究顯示兼顧了體液免疫和細胞免疫兩個方面，為新型瘧疾疫苗的研究奠定了理論和實踐基礎。

[參考文獻]

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[4] 沈燕，趙亞，黃豫曉，等.惡性瘧原蟲復合多表位基因的原核表達和多克隆抗體制備[J].科學技術與工程，2012，12（22）：5438-5443.

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（收稿日期：2013-04-10）