NF－κB和AQP－4在亞低溫治療大鼠腦出血中的作用

藍琳友 洪溪屏 蔡元暉

腦出血具有高發生率、高致殘率和高致死率的特點，目前尚無明確和有效的治療手段。當前研究表明，腦出血后腦水腫和腦組織繼發性損傷與炎性介質的大量表達密切相關［1］。核因子－κB(nuclear factor－κB，NF－κB)作為一種廣泛存在、功能多樣的轉錄因子，其活化后可調控多種炎癥因子的表達，從而在炎癥級聯反應中發揮了關鍵調控作用，但NF－κB如何在腦出血后炎癥反應機制中發揮作用，尚不十分清楚［2］。為此，本研究建立大鼠腦出血模型，觀察亞低溫對模型大鼠腦水腫及NF－κB和AQP－4表達的影響，為亞低溫在腦出血中的應用提供實驗依據。

材料與方法

1．動物和材料:成年雄性 SD大鼠96只，4周齡，體重304．5±25．4g，購自上海斯萊克實驗動物公司;EMSA試劑盒購自美國Pierce公司;AQP－4和β－actin抗體購自美國Epitomics公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司。

2動物分組和模型制備:將SD大鼠按照隨機數字表法分成3組:假手術組(SO)、常溫組(NT)和亞低溫組(HT)，每組再分別按1、2、3和4天4個時間點分為4個亞組，每組8只大鼠。按照Xue等［3］報道的將自體股動脈血注入大鼠尾殼核的方法制備實驗性腦出血模型，假手術組制備過程完全一致，但進針尾殼核后不注血。大鼠醒麻醉后，根據Longa EZ等［4］的方法進行神經功能評分，首次評分在1～3分者為造模成功，作為本次實驗用大鼠。

3．實施亞低溫:HT組在制備腦出血模型后即刻開始用冰袋及動物表面噴灑乙醇實施亞低溫，使大鼠肛溫在10min內降至33．0±0．4℃，并維持2h，治療結束后采用白熾燈局部加熱法，使動物肛溫恢復正常;假手術組和常溫組采用白熾燈局部加熱法，通過調節燈泡與大鼠的距離使大鼠肛溫保持在37.0±0．3℃。腦溫的測試和維持采用電子溫度計測量大鼠肛溫間接代替腦溫。

4．腦組織水分含量測定:實驗大鼠分別在腦出血后第1、2、3和4天，戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取腦，將大腦半球自中線切開，切取血腫周圍腦組織，濾紙吸干腦組織表面水分及血漬，稱取腦濕重(g)后至60℃烤箱中干燥48h至恒重后稱取干重(g)，計算腦含水量。腦組織含水量(%)=(濕重－干重)×100%。

5．EMSA實驗:取不同組別腦組織提取核蛋白。EMSA實驗方法參照文獻［5］，探針序列為:5'－TACTAGCTACCTCGTGTCAG－3'，將6．5%非變性聚丙烯酰胺凝膠在電壓為120V條件下恒壓電泳60min，取10μg核蛋白加入超純水中室溫反應30min后再加入生物素標記探針，在室溫下反應30min后電泳100min再印跡轉移，用帶正電荷尼龍膜380mA恒流電轉40min，轉移完后將尼龍膜至于紫外燈下交聯15min，將膜再用30ml封閉液在室溫下反應20min，最后將膜放入平衡液中反應15min，化學發光顯色，條帶曝光強度用Quantity One 4．6．2(BIO，RAD)軟件分析，計算灰度值。

6．Western blot法檢測腦組織中蛋白的表達:將腦組織粉碎后加入RIPA裂解液裂解細胞，提取上清液。用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(20微克/孔)，常規8%SDS－PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶1000)于4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗(1∶2500)室溫孵育1h，ECL顯色，條帶曝光強度用Quantity One軟件分析，以β－actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

圖1 EMSA檢測各組在不同時間點時腦組織NF－κB活性

結 果

1．各組腦組織含水量的變化:在不同時間點，與SO組相比較，NT組腦組織含水量均明顯升高(P＜0．05)，高峰出現在第4天。與NT組相比較，在第1天，HT組大鼠腦組織含水量無明顯差異(P＞0．05)，而在第2天、第3天和第4天中HT組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P＜0．05)，詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化(%，±s，n=8)

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化(%，±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

組別 1天 2天 3天 4天15．21 NT 組 84．28 ±15．28* 86．34 ±12．38* 88．37 ±10．67* 89．36 ±10．28 HT 組 77．28 ±14．46 71．30 ±15．85# 71．05 ±13．94# 72．19 ±13．57 SO 組 67．84 ±12．54 68．18 ±18．26 66．84 ±15．29 67．38 ±#

2．EMSA檢測NF－κB活性:各組大鼠腦組織均有不同程度NF－κB活性表達(圖1)。在不同時間點，NT組與SO組相比較，NF－κB活性均明顯增強(P ＜0．05)，NF－κB活性在NT組中在第1天時達峰。HT組大鼠NF－κB活性在造模1天后開始呈時間依賴性下降，在各時間點NT組NF－κB活性表達均明顯低于NT組(P＜0．05)，詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織NF－κB活性灰度值比較(±s，n=8)

表2 各組大鼠腦組織NF－κB活性灰度值比較(±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

組別 1天 2天 3天 4天0．076 NT 組 3．658 ±0．328* 2．749 ±0．435* 2．692 ±0．258* 2．464 ±0．317*HT 組 2．157 ±0．193# 1．042 ±0．098# 0．958 ±0．126# 0．884 ±0．094 SO 組 0．598 ±0．045 0．628 ±0．051 0．574 ±0．061 0．583 ±#

3．亞低溫對大鼠腦組織AQP－4蛋白表達的影響:各組大鼠腦組織中AQP－4蛋白均有表達。與SO組相比較，各時間點中NT組中AQP－4蛋白表達均顯著增加(P＜0．05)，NT組中大鼠腦組織AQP－4蛋白在第2天時達峰。與NT組相比較，亞低溫作用后大鼠腦組織中AQP－4 的表達水平均顯著降低(P＜0．05，表3、圖2)。

圖2 Western blot法檢測各組大鼠腦組織中AQP－4蛋白表達(以β－actin為內參)

表3 各組大鼠腦組織AQP－4蛋白灰度值比較(±s，n=8)

表3 各組大鼠腦組織AQP－4蛋白灰度值比較(±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

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4．NF－κB活性與AQP－4蛋白表達的相關性:對NF－κB活性與AQP－4蛋白表達進行Pearson相關性分析，NF－κB活性表達與AQP－4蛋白表達呈顯著正相關(r=0．945，P ＜0．01)。

討 論

目前我國每年新發40萬例腦出血患者，發生腦出血后30天的病死率可達50%，其中一半以上發生在發病后的24h內，嚴重危害患者的生活質量［5］。腦出血后腦組織損傷的機制相當復雜，凝血酶、炎癥反應、補體和血紅蛋白及其產物等機制均參與了腦出血后周圍組織水腫形成，而炎癥反應則是腦水腫形成的最直接因素。

NF－κB是近年來研究較多的一種功能多樣的細胞轉錄因子，通常以無活性的形式存在于細胞質中，當細胞受到出血、炎癥和損傷等刺激后NF－κB被激活，并進入細胞核中與相應的靶序列結合，活化后的NF－κB可誘導炎癥細胞因子、趨化因子和炎性酶等基因的表達［6］。有研究表明，腦出血后數分鐘可形成血腫，在出血后1h開始繼發性炎癥反應，而NF－κB在腦出血后數小時就被激活，從而在腦出血后腦水腫炎癥反應中起著關鍵作用［7］。另外，NF－κB激活后還可調控多種抗凋亡蛋白，同時在保護神經元細胞對抗凋亡中也發揮了一定作用［8］。水通道蛋白(AQPs)是一組近年來發現的細胞膜轉運蛋白，水通道蛋白廣泛分布于機體組織中，在介導水跨細胞膜轉運中發揮作用，其中水通道蛋白－4(AQP－4)在腦組織中含量最為豐富，主要分布在星形膠質細胞和室管膜細胞中，并在腦血液灌注和水腫形成與消退中發揮關鍵作用，因此與腦水腫的關系密切，抑制AQP－4的表達可減輕腦出血后腦損傷［9～11］。但目前尚未有NF－κB與AQP－4相關性研究報道。

本研究采用Xue等［3］報道的自體股動脈血向大鼠尾殼核注射的方法，注血量為50μl，與人類約50ml常見出血量相似，同時腦出血大鼠出現明顯對側肢體運動障礙和意識障礙等神經功能損傷的表現，從而成功復制出腦出血模型［12］。對大鼠腦出血后腦組織含水量進行分析可知，從第1天開始，腦出血后腦組織含水量明顯增加，呈明顯時間依賴性，高峰出現在第4天;通過檢測腦出血后腦血腫周圍組織NF－κB活性，發現NF－κB在腦出血后被廣泛激活，NF－κB活性在第1天時達到高峰，然后逐漸下降，在第4天時仍高于對照組，與張軒等［13］研究結果相似，但高峰持續時間較短，這可能與NF－κB活性表達在不同腦出血模型中表達異常有關，而AQP－4在腦出血后第1天開始表達明顯增加，隨著損傷時間的延長，AQP－4的表達也隨之升高，高峰出現在第2天，較NF－κB活性表達高峰(1天)延遲，在第3天和第4天，AQP－4的表達又逐漸降低。分析可知，AQP－4的表達與NF－κB活性表達曲線基本吻合，提示AQP－4的表達與NF－κB活性在大鼠腦出血模型中存在關聯，對NF－κB活性表達和AQP－4蛋白表達進行相關性分析表明兩者呈正相關，表明NF－κB和AQP－4在大鼠腦出血后腦血腫及炎癥中存在一定的協同作用，NF－κB被激活后可能通過上調AQP－4的表達從而發揮作用。在本研究中腦出血后腦水腫高峰時間在第4天，遲于NF－κB活性表達和AQP－4蛋白表達高峰，進一步表明腦出血后可激活NF－κB，進而調控AQP－4的表達，AQP－4表達增加可引起血腦屏障通透性增加，最終導致腦組織含水量的增加。因此，大鼠腦出血后腦組織含水量與NF－κB的激活顯著相關，NF－κB在調控腦出血后水腫形成的病理生理過程中發揮了關鍵作用。

亞低溫是一種利用物理手段使得機體溫度降至32～35℃，研究表明，亞低溫在腦卒中和缺血再灌注等疾病中發揮了一定的保護腦神經功能的作用，但機制尚未十分明確［14］。有研究表明，缺氧誘導因子－1α和血管內皮生長因子可能在亞低溫發揮腦神經保護作用中發揮了一定作用［15］。另外亞低溫需要考慮持續時間對療效的影響，因此本次研究參考宋宇等［16］的方法采用相對短的時間(2h)作為本次實驗中亞低溫的持續時間，從而避免深低溫對機體的不良反應。在本次實驗中，在大鼠腦出血后隨機對實驗動物實施亞低溫治療，筆者發現亞低溫可明顯降低大鼠腦出血后腦組織含水量，另外亞低溫還可顯著抑制NF－κB的活性表達和AQP－4表達，從而表明亞低溫可能通過抑制NF－κB的活性表達來抑制AQP－4的表達，最終抑制腦出血后腦組織炎癥程度，來達到對腦出血后腦保護的作用。雖然NF－κB的活性表達在早期可能具有短暫性的抗神經元細胞凋亡的作用，但NF－κB的持續激活可調控炎癥級聯效應中多種蛋白的表達，最終對腦組織產生損害作用。因此，鑒于NF－κB的激活對腦組織具有保護和破壞的雙重作用，在臨床應用亞低溫治療腦出血時，如何將NF－κB的活性表達控制在一個合理范圍內，有待于進一步研究。

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2 Ito H，Yamamoto N，Arima H，et al．Interleukin－1beta induces the expression of aquaporin－4 through a nuclear factor－kappaB pathway in rat astrocytes［J］．J Neurochem，2006，99(1):107－118

3 Xue M，Del Bigio MR．Intracerebral injection of autologous whole blood in rats:time course of inflammation and cell death［J］．Neurosci Lett，2000，283(3):230 －232

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84－91

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6 Wang YX，Yan A，Ma ZH，et al．Nuclear factor－κB and apoptosis in patients with intracerebral hemorrhage［J］．J Clin Neurosci，2011，18(10):1392－1395

7 Aronowski J，Hall CE．New horizons for primary intracerebral hemorrhage treatment:experience from preclinical studies［J］．Neurol Res，2005，27(3):268－279

8 Akizuki M，Yamashita H，Uemura K，et al．Optineurin suppression causes neuronal cell death via NF－κB pathway［J］．J Neurochem，2013，126(6):699－704

9 Ding Z，Zhang J，Xu J，et al．Propofol administration modulates AQP－4 expression and brain edema after traumatic brain injury［J］．Cell Biochem Biophys，2013，67(2):615－622

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13 張軒，邵恩得，田世文．高血壓性大鼠腦出血血腫量對NF－κB表達的影響［J］．河北醫藥，2009，31(14):1732－1734

14 殷玉華，李明，賈鋒，等．亞低溫干預對創傷性顱腦損傷大鼠海馬組織CIB1表達的影響［J］．上海交通大學學報:醫學版，2013，33(4):392－395

15 王曉萍，趙燊，林慶明，等．亞低溫對大鼠腦出血后腦水腫及缺氧誘導因子－1α、血管內皮生長因子表達的影響［J］．中華急診醫學雜志，2013，22(5):496－500

16 宋宇，王立義，魏志玄．亞低溫對腦損傷大鼠海馬區Cyt－C、Bcl－XL、Bcl－XS表達的影響［J］．中華急診醫學雜志，2012，21(12):1319－1321