Hsa-miR-486 -5p 的腫瘤及細胞骨架相關靶基因的預測分析

孫慧燕 楊曉明 王立生

microRNAs(miRNAs)是大小為19 ～25bp 的非編碼小RNA，其可以在轉錄后和(或)轉錄水平負調控靶基因的表達［1，2］。Hsa-miR-486 -5p 是由鄭曉飛教授課題組于2005 年利用人胎肝組織研究microRNA 鑒定方法時首先鑒定并注冊的5 種新microRNAs(miR-483 ～miR -487)之一［3］。目前，關于miR -486 的表達及生物學功能的文獻報道非常有限。2010 年，由Olson 所指導課題組在Proc Natl Acad Sci上闡明miR -486 在肌肉高表達，并可能是PI3K/AKT 的調控基因，預言miR -486 在肌肉萎縮的病理生理過程中起重要作用［4］。2011 年，由Kunke 所指導課題組在《Skeletal Muscle》雜志上進一步闡明miR-486 在杜興肌肉營養不良癥(duchenne muscular dystrophy，DMD)的病理過程中起到重要調控作用［5］。在這兩篇文章中都提到miR -486 的宿主基因為ANK1，而后者屬于錨蛋白家族，與細胞骨架運動密切相關。Kim 等［6］認為，miR -486 -5p 是SIRT1 的內源性抑制劑，能誘導人脂肪組織來源的間充質干細胞(human adipose tissue - derived mesenchymal stem cells，hAT - MSCs)復制性衰老，而SIRT1 被證實是miR-486 -5p 的靶基因。有研究者認為，miR -486在胃癌中是一新的抑癌miRNA，其靶基因為抗凋亡基因OLFM4［7］。PNAS 提到miR-486 在肺癌中表達降低，其靶基因為胰島素生長因子信號途徑中的IGF1、IGF1R 及PIK3R1 等，miR -486 很可能是肺癌的一個新的抑癌基因［8］。目前，對miR -486 的認識還很不清楚，甚至在不同的組織其作用是相反的。因此，有必要借助生物信息學的一些預測軟件結合筆者的實驗數據進行分析，以利于得出更客觀的結論。TargetScan 是由MIT 提供的在線對microRNAs 進行靶基因預測的軟件之一，其能鏈接microRNA 相應靶基因的研究數據，并能提供靶基因3'UTRs 相關信息。在筆者的實驗過程中，發現miR -486 對癌細胞的遷移、增殖和細胞形態產生了影響。因此，利用TargetScan 5.2 軟件對其促癌及細胞骨架相關靶基因進行了預測研究，以期對miR -486 的進一步研究起到指導作用。

TargetScan 預測hsa-miR-486 -5p 有106 個保守靶基因，共有109 個保守位點，22 個保守性不好的位點。106 個保守靶基因中與促進癌癥發生發展有關的有16 個，與細胞骨架有關的有9 個，當然它們也會有交叉，比如CLDN10 和CIT 與細胞骨架有關，同時也是很多腫瘤的促癌基因。除了這類基因外，筆者也發現了一些與之無關或相反的靶基因，在本文中沒有敘述，因為它們可能會在其他的生理或病理生理過程中起作用。隨著預測手段的進步，這些數字還會發生改變。但本文主要是想提供一種思路和參考。

一、促癌相關靶基因

以下排序依據網站提供順序，與功能大小無關。

1. PLAGL2:PLAGL2(pleiomorphic adenoma gene like 2，PLAGL2)是一類來源于PLAG 基因家族(PLAG1，PLAGL1 和PLAGL2)的鋅指蛋白，其基因位于染色體20q11.1，是一種急性髓系白血病的促癌基因［9，10］。這可以提示miR-486 可能會與血液系統疾病有關。

2.ARID4B:ARID4B(AT -rich interactive domain-containing protein 4B)蛋白由ARID4B 基因編碼的蛋白質。ARID4B 是組蛋白去乙酰酶依賴的SIN3A轉錄輔助抑制復合體的組成部分，其參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發生等。從一位乳腺癌患者分離出此基因的IgG 抗體。在ARID4B 上鑒定出一新的乳腺癌抗原表位SSKKQKRSHK，其表達和乳腺癌的進程有關，因此血清中抗體的水平可能對乳腺癌的診斷有幫助［11］。

3.AFF3:AFF3(AF4/FMR2 family member 3)核轉錄因子在淋巴發展和腫瘤發生中有重要作用。在一些ALL 患者，此基因和MLL 有融合現象［12］。

4.SFRS3:也被稱為SRp20。Zheng 等發現splicing factor SRp20 (SFRS3)在癌中高表達，其調控Forkhead box transcription factor M1 (FoxM1)和后者靶基因PLK1 和Cdc25B 的表達，影響細胞周期和增殖。小RNA 干擾SRp20 的表達，引起G2/M 阻滯，生長延緩和凋亡。在成纖維細胞過表達SRp20 引起細胞過度增殖和轉化，在體內能誘導成瘤。因此，SRp20 在腫瘤細胞過表達是腫瘤發生、發展和維持的重要步驟［13］。

5. OLFM4:OLFM4 是olfactomedin domain - containing 蛋白家族成員，其在胃腸道(胃、小腸、大腸)、前列腺和骨髓表達較高。最近研究認為OLFM4 參與到一些惡性腫瘤的發生、發展中，尤其是胃腸道腫瘤。OLFM4 對腫瘤細胞有抗凋亡和促增殖作用，并且與腫瘤細胞的黏附和轉移都有關系［14，15］。另有實驗證實OLFM4 作為miR-486 的靶基因在胃癌中起重要作用［16］。OLFM4 除了在胃腸道腫瘤的發生發展中有關鍵作用外，Chen 等發現其可參與宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌的分化。因此OLFM4 也有可能在女性生殖道腫瘤中扮演重要角色［17］。

6.EphA3:EphA3 屬于Eph/ephrin 酪氨酸激酶系統的組成成分之一，后者在細胞增殖與活力、細胞骨架、細胞遷移和抗細胞凋亡中起重要作用。Eph 受體酪氨酸激酶家族可以控制多種細胞生物學過程:細胞黏附和運動、細胞塑形和細胞生長。EphA3 是癌中最多的Eph 受體突變體，其與癌癥的關系很復雜［18］。EphA3 和CD133 在結直腸癌中高表達，并且其與腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、遠端轉移和TNM分期正相關。高表達EphA3 和CD133 的結直腸癌患者其生存期較短。EphA3 和CD133 可以作為結直腸癌的臨床評價指標［19］。

7.Sp5:Sp5 屬于SP 鋅指轉錄因子家族，其編碼C2H2 鋅指蛋白，C 末端有DNA 結合域。Sp5 在多種腫瘤(HCC、胃癌、腸癌)中高表達。乳腺癌細胞株MCF-7 不表達內源性Sp5，將Sp5 轉移入MCF -7細胞后，能明顯促進細胞增殖。

8.PIK3R1:PIK3R1(phosphatidylinositol 3 -kinase regulatory subunit alpha)是胰島素生長因子信號途徑中一種重要的酶。利用慢病毒介導的shRNA 策略敲減此基因在多形性成膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)細胞的表達，可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲。敲減PIK3CA 或PIK3R1 可降低FAK 活性，敲減PIK3R1 可降低MMP2 表達，推測PIK3R1 像PIK3CA 一樣可以影響腫瘤細胞的增殖和遷移，是GBM 的一個潛在治療靶點。而Croce 等的研究結果認為，不僅PIK3R1 是miR -486 在肺癌中的靶基因，其他相關分子IGF1、IGF1R 也作為miR-486 在肺癌中的靶基因發揮重要作用［8］。

9. PIM1:PIM1(proto - oncogene serine/threonine-protein kinase Pim-1)為絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，PIM 亞家族。主要在B 淋巴和髓系細胞系表達，在血液系統腫瘤和前列腺癌高表達。可促進細胞細胞增殖和存活。Pim -1 的特異性單抗p9 明顯抑制細胞增殖。

10.C1orf21:C1orf21(chromosome 1 open reading frame 21)基因與胃癌有關。

11.SMOC1:SMOC1(SPARC-related modular calcium-binding protein 1)在少突神經膠質瘤高表達。實驗證實在體外SMOC1 可以與tenascin -C 相互作用。在U87 神經膠質瘤細胞SMOC1 可以影響其遷移。

12.CXCR5:CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)屬于G 蛋白偶聯受體，在Burkitt's 淋巴瘤中高表達，其在B 細胞的遷移中起重要作用。趨化因子和其受體參與前列腺癌(prostate cancer，PCa)的轉移。CXCR5 在PCa 明顯高表達。在PCa 細胞侵襲和遷移中具有重要作用。

13.Gab2:Gab2(GRB2 -associated -binding protein 2)是激活磷脂酰肌醇3 (phosphatidylinositol 3 -kinase，PI3K)的適配體蛋白。其在乳腺癌和轉移性黑素瘤中高表達，是一原癌基因蛋白。除此，Gab2 在肺癌中也高表達，提示其在肺癌的發生、發展中也起到一定的作用。Docking 蛋白在多種腫瘤中高表達，并且與轉移特性有密切關系。Gab2 在乳腺上皮細胞MCF-10A 高表達后可阻滯細胞伸展，減弱應力纖維和成熟黏著斑，促進細胞遷移。

14.BZW1:黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是唾液腺最普遍的一種惡性腫瘤。Situ等證實BZW1(basic leucine zipper and W2 domain -containing protein 1)在MEC 生長中具有重要作用。利用qPCR 和免疫組化證實BZW1 在MEC 組織和細胞中高表達，而且與病情分級有關。利用特異RNA干擾慢病毒抑制BZW1 表達則抑制Mc3 細胞增殖和克隆形成，并且使細胞停留在G0/G1期。抑制細胞遷移和侵襲，在體內實驗中也得到了相同的結果。

15.SFRS1:SFRS1 也稱為SF2/ASF，被認為是一種原癌蛋白。利用免疫組化方法在81 例非小細胞肺癌(non -small cell lung cancer，NSCLC)患者的癌組織中檢測SF2/ASF 的表達，結果顯示大部分原發性NSCLC 腫瘤組織中SF2/ASF 都高表達。體外實驗中，小RNA 干擾SF2/ASF 促進了NSCLC 細胞系的凋亡，其機制與survivin- mTORC1 - 4E-BP1 有關。

16.SRF:SRF 調控立早基因的轉錄，引起多種細胞增殖、遷移和分化。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤的侵襲和轉移中具有重要作用。利用Western blot 法檢測SRF 和MMP -2 and MMP-9 在HCC 組織中的表達，發現對比癌旁組織這3 種基因明顯升高。高表達SRF 的組織中MMP-2 and MMP-9 的表達也增高。在HLE 細胞中過表達SRF 后，MMP -2 和MMP -9 的表達和酶活性均增加，且細胞遷移能力增加。

二、細胞骨架相關靶基因

1. SLC10A7:SLC10A7［solute carrier family 10(sodium/bile acid cotransporter family)，member 7］屬于SLC10 家族成員，但不同于其他成員，其有10 個穿膜結構域。SLC10A7 相關蛋白不僅存在于脊椎動物，還存在于酵母、植物甚至細菌。因此，SLC10A7 為分布最廣泛的載體家族成員。

2.COL6A6:COL6A6(collagen，type Ⅵ，alpha 6)膠原蛋白Ⅵ是調控上皮細胞-纖連蛋白的重要基膜成分，是一種細胞結合蛋白。

3. TWF1:TWF1 編碼一種肌動蛋白結合蛋白twinfilin，非常保守。定位于cortical G - actin - rich structures，受小GTPase RAC1 調控。它同時作為microRNA-1 的靶基因在心肌肥大的病理生理學過程中起重要作用。

4. CLDN10:此基因編碼claudin 家族中一員。claudin 家族是integral 膜蛋白，參與組成緊密連接。CLDN10 與HCC 的復發密切相關，CLDN10 在肺癌中也普遍表達。CLDN10 在HCC 高表達，而且與血管生成緊密相關，其可作為HCC 術后不良預后的有用指標。CLDN10 在HCC 的侵襲中起重要作用，可作為HCC 治療的潛在靶點。Han 等發現CLDN10 可以作為雞卵巢癌的新生標志物，由于以雞作為合適的動物模型，因此這對人類卵巢癌的預測也具有一定的意義。

5.ARHGAP5:ARHGAP5(Rho GTPase -activating protein 5)編碼p190 -B RhoGAP，后者負調控RhoA活性從而促進HuH-7 肝癌細胞伸展和遷移。

6. CIT:CITRON (rho - interacting，serine/threonine kinase 21)，簡稱CIT，此基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞中間體的重要成分，在細胞分裂中起重要作用，參與中樞神經系統發育。CITRON 在HCC 癌組織中高表達，在SMMC -7721 細胞中用腺病毒介導的方式敲除CITRON，抑制細胞的增殖和克隆形成。在裸鼠荷瘤實驗中發現敲減CITRON 可以抑制腫瘤的形成。

7. RICH2:RICH2，又被稱為ARHGAP44(Rho GTPase activating protein 44)。敲減CD317 或RICH2會產生同樣的表型:頂端肌動蛋白網絡的消失，伴隨頂端微絨毛的消失。同時，基底面肌動蛋白束增加;細胞高度縮減而緊密連接沒有任何改變。抑制上皮轉化和頂端及基膜蛋白的極化。

8.MKL1:巨核細胞白血病蛋白1(megakaryoblastic leukemia protein -1，MKL1)，也稱MAL、MRTF -A、BSAC，屬于MRTF 轉錄因子家族，后者有共同的肌動蛋白結合域和轉錄激活域等。MKL1 調控多種過程:肌細胞分化、心血管發育、神經系統發育、巨核細胞分化和遷移、細胞運動和上皮間質轉化。MKL1 在腫瘤方面起到雙重作用:腫瘤促進和腫瘤抑制。有實驗證實，MRTF-A 在肺纖維化的膠原合成中起重要調控作用，而這依賴于SRF 和Sp1 對膠原表達的轉錄調控。

9.MYLK2:此基因編碼肌球蛋白輕鏈激酶，廣泛分布于成人骨骼肌中。在腫瘤中MYLK2 激酶域很少發生突變，在腫瘤發生中不扮演重要角色。

綜上所述，microRNAs 的功能研究離不開其靶基因的預測。目前，應用于靶基因預測的數據庫有miRbase、starBase、Tarbase、miRecords、targetScan、Pic-Tar、miRanda 和microRNA.org 等。Targetscan 是基于靶mRNA 序列的進化保守等特征搜尋動物的microRNA 靶基因的軟件，其預測microRNA 靶標假陽性率較低。筆者利用此網站，結合實驗數據進行了有效的靶基因預測分選，為課題的順利進行打下了良好的基礎。

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