中藥對惡性黑色素瘤細胞體內外作用的研究進展

張石琳 鄒征云

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)簡稱惡黑，是一種惡性程度極高的腫瘤，是由黑色素細胞異常增生產生的，該細胞能產生黑色素，色素合成和酪氨酸代謝異常可致惡黑的形成，故其大多原發于皮膚，也可起源于眼、鼻腔等其他器官。惡黑浸潤和遷移能力強，擴散迅速，早期即可發生轉移，轉移部位多見于肺、腦［1］。近幾年其發病率和病死率都急劇上升，并呈年輕化趨勢，患者可在診斷數月內死亡［2］。惡黑的預后受年齡、性別、發生部位、腫瘤Breslow 厚度及Clark 浸潤深度等因素影響。手術是本病早期的重要治療手段，一旦確診應盡快手術切除，但易復發。后期主要化學治療，多藥聯合化療療效稍高于單藥化療，放射治療在手術切除不徹底、拒絕手術及不能手術者中有一定的療效，此外還有的治療手段包括免疫治療、基因治療、生物化療，均是目前臨床應用較常見的手段，但療效不太理想。細胞間縫隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)是細胞間傳遞、交換物質的重要的直接信息通道，是細胞間通訊的主要形式，腫瘤組織細胞間正因為該縫隙連接(GJ)數量減少，物質交流通道的缺乏，導致化療藥物難以擴散到腫瘤組織而達到預期的有效濃度，抗腫瘤作用因此被削弱［3］。

一、惡性黑色素瘤中醫概況

中醫并無“惡性黑色素瘤”病名，屬黑療、惡瘡、失榮等范疇。先天不足，衛外失固，臟腑虛損，毒邪乘虛而入，與血氣相博，邪留肌膚，致黑療、惡瘡。對于該病的中醫治療，強調辨證論治，扶正祛邪為宗旨，貫穿腫瘤發生、發展全過程。故郁仁存教授［4］在腫瘤治療中提出了“內虛學說”“平衡學說”，以五臟辨證為主，尤重視肺脾腎三臟，整個療程分3 個時期，即化療前，補益脾腎、祛邪解毒為主，以增強抗腫瘤作用;化療時，和胃降逆、醒脾調中為主，以減輕化療毒不良反應;化療后，補益氣血、溫腎化瘀為主，并加用現代藥理研究證實確有抗腫瘤作用的中草藥，輔助協助抗腫瘤。中醫治療是我國的特色治療方法，中藥乃我國的特色資源寶庫，其種類繁多，在抗腫瘤治療方面具有其獨特的優勢，從中藥中尋找具有抗腫瘤作用的藥物具有廣闊的前景。

二、中藥對惡性黑色素瘤的體內外作用機制

1.抑制惡黑細胞增殖，促進細胞凋亡:中藥姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種酚類色素，是姜黃的主要有效成分，其抗腫瘤作用研究較多。姜黃素以12.5、25.0、50.0、100.0μg/ml 4 個濃度梯度作用于黑色素瘤B16 - F10 細胞，分別培養24、48、72h，可顯著抑制細胞的增殖，促進其凋亡，并呈時間和劑量的依賴性［5］。研究發現白藜蘆醇抑制小鼠B16 黑色素瘤細胞及A375 人惡性黑色素瘤細胞增殖，與抑制p-Akt 蛋白的表達，降低細胞線粒體膜電位及激活caspase-3 有密切關系［6］。

細胞凋亡是細胞死亡的兩種方式之一，其發生與基因調節有關，也被稱為程序性細胞死亡，關系到腫瘤的發生、發展和消退。邱實等［7］研究發現姜黃素作用于A375 人惡黑細胞12h 即可觀察到細胞凋亡，在一定劑量范圍內呈時間-劑量依賴性，同時發現在凋亡過程中c -myc 基因表達水平降低，caspase -3的表達顯著升高，說明c -myc 表達的減少和caspase-3 表達的增加可能與姜黃素誘導A375 細胞凋亡有著密切的關系。陸雪芬［8］采用系統溶劑萃取法提取中藥白及各部位成分，發現白及的氯仿層和乙酸乙酯層均可誘導B16 小鼠惡黑細胞凋亡，氯仿層效果更明顯，可能為抑制細胞增殖的作用機制之一。

2.抑制惡黑細胞黏附、侵襲和轉移:惡性腫瘤最主要的特點是具有局部浸潤和遠處轉移的能力，也是致死的主要原因。腫瘤的轉移、侵襲是癌細胞與宿主細胞及基質相互作用的結果，黏附性是腫瘤細胞重要的功能之一，為腫瘤的生長提供了一個舒適的微環境，所以尋找破壞該黏附作用的藥物也是抗腫瘤的一大突破。白藜蘆醇是近年來研究較多的一味抗腫瘤中藥單體，通過實驗，采用細胞染色、慢速聚集法，發現其對B16BL6、A375、M14、MV13 惡黑細胞與基質黏附均有抑制作用(P ＜0.05)，同時抑制了細胞聚集，為其抗腫瘤作用提供了依據［9，10］。袁華兵等［11］利用Transwell 小室研究開口箭皂苷，體外發現其對B16 -BL6 黑色素瘤細胞的轉移和侵襲有抑制作用，體內試驗通過對小鼠右后爪種植惡黑細胞，發現黑色素瘤向肺、脾、胸腺轉移，其中肺轉移較多，用開口箭皂苷藥物組肺轉移結節數明顯減少。研究發現女貞子多糖抑制了黑色素瘤細胞的黏附能力，可能與抑制黑色素瘤黏附分子E -cadherin 的表達有關，打破了腫瘤細胞之間的黏附能力，破壞了腫瘤細胞的整體性，故發揮了其抗腫瘤的作用［12］。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種特異性的內切酶，在惡性腫瘤細胞中普遍存在，參與腫瘤血管生成和侵襲轉移，降低其表達水平可能抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡［13］。郭勇等［14］通過體外培養人惡性黑色素瘤A375 細胞，不同濃度苦參堿對其作用，發現HPA mRNA 的表達、細胞黏附能力和侵襲能力均明顯抑制，差異有統計學意義，并且這種抑制作用隨苦參堿濃度的增加而增強，提示苦參堿可能通過下調腫瘤細胞HPA表達水平而抑制細胞浸潤和遠處轉移，從而達到抗腫瘤的目的。這也為抗腫瘤提供了一個新的依據。

3.誘導細胞分化:惡性腫瘤的發生是細胞分化異常的結果，這一過程是可逆的。誘導分化是指在分化誘導劑的作用下使惡性腫瘤細胞逆轉，向正常或接近正常細胞分化的現象。所以尋找分化誘導劑是非常有意義的。有對熊果酸(ursolic acid，UA)的研究發現其對B16 鼠惡黑細胞有較強的分化誘導作用，體外實驗中，實驗組經UA 作用后，細胞形態發生明顯變化，細胞核變小、規則，核質比減少，線粒體、粗面內質網等細胞器變豐富，說明細胞在正常化。體內實驗中，B16 細胞體內成瘤的能力顯著下降。結果說明UA 能明顯抑制B16 細胞增殖并呈時間和劑量依賴性，且形態向正常上皮細胞變化，惡性程度降低。趙連梅等［15］通過體外實驗，利用木鱉子醇提物(ethanol extract of cochinchina momordica seed，CMSEE)對小鼠黑素瘤B16 細胞作用，由原來的菱形或多邊形，經藥物處理后成梭形，并出現樹突狀結構，成典型的細胞分化狀態，并且這種誘導分化作用在低劑量時明顯，高劑量濃度的藥物作用后表現出細胞凋亡的狀態。說明CMSEE 誘導了黑素瘤細胞分化，可能為其抗腫瘤機制之一。

4.抑制腫瘤血管生成:惡性腫瘤的生長與轉移必須依靠新生血管提供足夠的營養才能實現。腫瘤屬于中醫積、癌等范疇，腫瘤患者的血液常處于一種高凝狀態，所謂血瘀則血行不暢，腫瘤的無限生長浸潤和轉移依賴于血液的滋潤，豐富的血管網便是通道。腫瘤新生血管形成是血管中的內皮細胞在腫瘤細胞分泌的多種正負調節生長因子的共同調控作用下，增生、延伸而生成新的血管的過程，這些生長因子最重要的是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。其誘導血管生成作用最強、特異性最高。也有與促血管生成素- 2(angiopoietin -2，Ang-2)相關的［16］。腫瘤新生血管為腫瘤細胞向繼發部位、遠處轉移提供了一條便捷的通道，增加了腫瘤細胞進入微循環的機會。因此，抑制和破壞腫瘤新生血管，阻斷腫瘤血供，使腫瘤細胞壞死及阻斷轉移，已成為腫瘤治療中一個有效的新策略。有研究者從120多種中草藥中篩選出兩種抗黑色素瘤效果比較好的中草藥石蒜和黃連，實驗對這兩者的單體成分鹽酸石蒜堿(LH)和鹽酸藥根堿(JH)進行抗黑色素瘤血管形成作用研究，發現兩者對人高轉移黑色素瘤C8161細胞主導的新生血管形成具有很好的抑制作用，其機制可能與下調血管形成的關鍵基因VE -cadherin 在C8161 細胞的表達，及抑制VE-cadherin 啟動子的活性有關。人參皂苷Rg3 可明顯抑制B16 黑色素瘤細胞的血管生成，可能通過下調VEGF 表達有關，實現抑制腫瘤新生血管形成的作用，進而抑制B16 黑色素瘤細胞的生長和轉移［17］。

5.增強免疫:機體的免疫監視體系在防止腫瘤發生上起重要作用，腫瘤的發生是免疫監視功能喪失的結果。腫瘤可通過多種途徑逃避機體免疫系統的監視和攻擊。機體免疫力低下時對腫瘤細胞的免疫監視功能減弱，免疫功能低下的腫瘤患者預后也差。因此，阻斷腫瘤的免疫逃逸，對腫瘤的治療尤為重要，其中中藥多糖的發現無疑為這一領域提供了可靠的依據。Lin 等［18］通過近5 年來對多糖的研究發現，有些多糖對腫瘤細胞無直接抑制作用，而是通過增強機體的免疫功能來發揮抗腫瘤作用，多糖的免疫調節作用是目前公認的抗腫瘤作用的主要機制之一。有研究者在體外實驗中，利用高轉移性的小鼠黑色素瘤B16F10 細胞培養上清作用于同基因小鼠脾淋巴細胞，發現腫瘤細胞培養上清對同基因小鼠淋巴細胞有明顯抑制作用，實驗進一步用不同濃度的靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaccharides，Gl - PS)對共培養系統作用，實驗結果提示靈芝多糖可在不同程度上拮抗腫瘤細胞培養上清對淋巴細胞的抑制作用，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。

6.抑制酪氨酸酶活性和黑色素合成:酪氨酸酶(tyrosinase)又稱為多酚氧化酶(polyphenol oxidase)，是黑色素生物合成的主要限速酶，其活性的大小直接決定黑色素的合成，它不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素細胞成熟的特征性標志。抑制酪氨酸酶的活性可阻止黑色素的合成。該酶催化L -酪氨酸羥基化成L-多巴，再氧化形成多巴醌，再經過一系列的氧化作用最后形成黑色素。紅景天、三葉青提取物等，在一定濃度范圍內對惡黑細胞增殖有抑制作用，同時酪氨酸酶活性降低，黑色素生成減少，這可能是抑制黑色素瘤細胞生長的機制之一［19，20］。研究發現驅蟲斑鳩菊提取物質量濃度＜10mg/L 范圍內，對酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趨勢，并隨濃度增加可抑制人惡性黑色素瘤A375 細胞的增殖，＞20mg/L 時，顯示一定的細胞毒性作用。杏仁油對小鼠黑色素瘤細胞B16 酪氨酸酶活性和黑色素生成有較強的劑量相關性抑制作用，這也為杏仁油在治療色素沉著性皮膚病的應用提供了理論基礎。

7.下調抗凋亡基因、促進凋亡蛋白表達:中藥藤黃一直以來是人們研究的熱點，有效成分藤黃酸作為抗腫瘤一類新藥在2004 年確定為國家“863”計劃第3 批新立項項目。藤黃酸對A375 細胞的生長抑制作用具有明顯的時間-劑量依賴性，同時下調Bcl -2蛋白表達，Bax 表達增高，兩者比率Bcl -2/Bax 下降則抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。Bcl -2 蛋白為抗凋亡蛋白，Bax 蛋白為凋亡蛋白，Bcl -2 蛋白具有抑制Bax 的功能。Bcl -2/Bax 比例升高，則抑制細胞凋亡，反之，則促進細胞凋亡。這也為抗腫瘤機制提供了一個新的研發點。

惡性黑色素瘤在我國發病率呈逐年上升趨勢，應引起足夠的重視。在臨床上，對惡性黑色素瘤的診斷、治療理應做到早發現、早治療，以減少腫瘤轉移的機會，在運用傳統的治療方案基礎上，開發研究新型藥物顯得更為重要，中藥作為我國特色的資源產物，對惡黑細胞有一定的抑制作用，將其開發應用于臨床具有重要的意義。

1 王爾兵，王肇炎. 惡性黑色素瘤的分子靶向藥物治療研究進展［J］.醫藥導報，2012，31(10):1333 -1336

2 McLoughlin JM，Zager JS，Sondak VK，et al. Treatment options for limited or symptomatic metastatic melanoma［J］. Cancer Control，2008，15(3):239 -247

3 Chen W，Yan C，Hou J，et al. ATRA enhances bystander effect of suicide gene therapy in the treatment of prostate cancer［J］. Urol Oncol，2008，26(4):397 -405

4 程培育，李辰慧，張青.郁仁存治療惡性黑色素瘤經驗［J］.北京中醫藥，2013，32(7):515 -517

5 張亮，萬義增.姜黃素對黑色素瘤B16 -F10 細胞增殖及線粒體凋亡影響的機制研究［J］. 中國社區醫師:醫學專業，2012，14(21):8 -9

6 劉浩，蔣琛琛，程秀，等.白藜蘆醇對人黑色素瘤細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(7):998 -1002

7 邱實，譚升順.姜黃素對人黑素瘤A375 細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國皮膚性病學雜志，2009，23(11):706 -707

8 陸雪芬.白及提取物對小鼠黑色素瘤B16 細胞誘導凋亡作用的研究［J］.中華中醫藥學刊，2013，31(7):1619 -1621

9 Lee SJ，Kim MM. Resveratrol with antioxidant activity inhibits matrix metalloproteinase via modulation of SIRT1 in human fibrosarcoma cells［J］. Life Sci，2011，88(11 -12):465 -472

10 顧煜琛.白藜蘆醇對黑色素瘤細胞黏附生物學行為的影響［J］.南京中醫藥大學學報，2012，28(1):92 -94

11 袁華兵，林平發，陶曉軍.開口箭皂苷抗黑色素瘤侵襲與轉移作用研究［J］.醫藥導報，2013，32(8):1018 -1020

12 Li L，Qiu R，Cheng G，et al. The adhesion effect of ligustrum lucidum A it polysaccharide on melanoma B16BL6 in vitro［J］. Chinese Pharmaco Logical Bulletin，2009，25(10):1367 -1369

13 Barash U，Cohen-kaplan V，Dowek I，et al. Proteoglycans in health and disease:new concepts for heparanase function in tumor progression and metastasis［J］. FEBS J，2010，277(19):3890 -3903

14 郭勇，秦建嶺，方勇，等. 復方藤梨根制劑下調乙酰肝素酶表達抑制胃癌細胞轉移［J］.中華中醫藥學刊，2010，28(3):461 -463

15 趙連梅，韓麗娜，耿藝曼. 木鱉子醇提物誘導小鼠黑素瘤B16 細胞分化的作用機制［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2012，19(4):381-386

16 鄭振茹，王亞珍，呂品田，等. 赤芍總苷對人黑色素瘤細胞A375血管生成因子VEGF 和Ang -2 的影響［J］. 醫學動物防制，2012，27(12):1095 -1097

17 辛穎，姜新，崔俊生，等.人參皂苷Rg3 抑制B16 黑色素瘤新生血管生成及其機制的探討［J］. 中華腫瘤防治雜志，2010，17(8):590 -593

18 Lin J，Ping L，Chen KS，et al. Advance in studies on anti-tumor activity of polysaccharides in latest five years［J］. Zhongguo Zhong Yao Zazhi，2013，38(8):1116 -1125

19 Chiang HM，Chien YC，Wu CH，et al. Hydroalcoholic extract of Rhodiola rosea L. (Crassulaceae)and its hydrolysate inhibit melanogenesis in B16F0 cells by regulating the CREB/MITF/tyrosinase pathway［J］.Food Chem Toxicol，2014，65:129 -139

20 呂雯婷，顧書暢，丁麗，等.三葉青提取物對A375 細胞增殖酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響［J］. 今日藥學，2011，21(10):624-626