過表達mimecan 對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的作用初探

王 晶 沈瓊娜 張惠潔 胡小磊 陳鳳玲

骨生成誘導因子(osteoinductive factor，OIF)，又名mimecan 或osteoglycin，最早從牛的骨基質中提取出來的一種分泌蛋白［1，2］。Mimecan 屬于亮氨酸富集蛋白家族成員，在不同物種間該基因的結構高度保守［3］。Mimecan 在人體卵巢、肺、角膜、腎上腺、食管、心臟等組織中廣泛表達，在調控膠原纖維形成及腫瘤細胞的增殖和遷移方面發揮了重要作用［4，5］。研究發現mimecan 與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)密切相關。Kampmann 等［6］發現在新生血管中mimecan 表達量下調，提示mimecan 可能與血管重塑相關。Kwon等［7］應用免疫組化染色技術發現，mimecan 在動脈硬化斑塊鈣化區的表達量升高。Borja 等［8］發現在發生AS 的血管中，mimecan 在血管中層表達下降，在激活的內皮和新生內膜中表達量上調。這些提示mimecan可能在AS 的發生發展過程中發揮重要作用。

本實驗在體外應用反轉錄病毒載體構建了穩定過表達mimecan 的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)模型，并且初步觀察過表達mimecan 后HUVEC 增殖和凋亡的變化，為進一步探索mimecan 與AS 的關系奠定基礎。

材料與方法

1.材料與試劑:pmscv -puromycin -IRES -GFP (pMSCV PIG)、VSV -G、gag -pol (Clontech 公司);限制性內切酶BglⅡ和XhoⅠ試劑盒(TaKaRa 公司);質粒小抽提試劑盒(Axygen 公司);中抽試劑盒(MN 公司);293T 人胚腎細胞株(293T 細胞)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(ATCC 公司);脂質體Lipo-fectamine 2000、Trizol (Invitrogen 公司);反轉錄和realtime PCR 試劑盒(Promega 公司)，細胞培養基DMEM、opti- MEM 培養基、胎牛血清(FBS)、嘌呤霉素(puromycin)(Gbico 公司);兔抗人FLAG 單抗(Sigma 公司)，兔抗人GAPDH 單抗、HRP 標記山羊抗兔二抗(Cell signal);Western blot化學發光試劑盒(Pierce 公司)。

2.HUVEC 及293T 細胞培養:HUVEC 及293T 細胞均以添加10%FBS 的DMEM 細胞培養基培養，培養基置于37℃、含5%CO2的細胞孵育箱中，細胞傳代比例1∶6，每2 ～3 天傳代1 次。

3.pMSCV PIG-OIF-3FLAG 反轉錄病毒載體的構建及鑒定:人mimecan 基因全長序列以含人mimecan 基因編碼序列框架的質粒為模板，經PCR 技術擴增，并分別添加了含3 個重復的FLAG 編碼序列和BglⅡ、XhoⅠ的酶切位點。……