大麻素受體2 在重癥急性胰腺炎肺損傷中的保護作用

李 鑫 張 鵬 柴 琛 王旭鋒 徐 松 魯 彥 曹 農

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)往往引起全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，繼而造成多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)。目前認為，SIRS 發展早期，因胰酶大量釋放導致單核-吞噬細胞和中性粒細胞過度激活，釋放大量炎性介質，造成多器官損害。在器官損害中，與免疫細胞在肺組織內過度激活和大量促炎性細胞因子(如TNF -α、IL-6、IL-1 等)的產生及釋放有密切關系的肺臟組織損傷出現較早較為突出［1，2］。在動物SAP 模型中研究提示，減少血清中TNF -α 的水平，能夠明顯減輕肺臟損傷的程度［3］。因此減少免疫細胞在肺組織的浸潤及促炎因子的水平，成為治療SAP 導致的肺損傷的一個重要而有效的方法。

大麻已具有2000 多年藥用歷史，1964 年確定大麻的有效成分為大麻素［4，5］。眾多研究已證明內源性大麻素及其受體在體內廣泛存在［6，7］。體內主要存在CB1 和CB2 兩種大麻素受體。CB1 受體研究比較多，該受體主要存在于腦組織中，稱為中樞型大麻素受體。相對CB1 受體，CB2 受體的研究相對不足，很多機制尚不明確［8］。CB2 受體為7 次跨膜G 蛋白偶聯受體。主要在B 細胞、T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等免疫細胞上表達，是巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞上主要的大麻素受體［9～11］。CB2受體可以激活多種細胞內信號轉導通路發揮作用，雖然這些信號通路尚不明確，但在大量的實驗研究中發現，CB2 受體激活后整體表現出抗炎和免疫抑制作用［11，12］。SAP 導致的SIRS 是MODS 發生、發展的主要因素，控制炎癥發展是預防及治療MODS 的重要措施。目前的研究表明，CB2 受體在一些炎性疾病中表現出一定的免疫抑制作用，但在SAP 中起到的作用的報道極少［12］。因此本研究就CB2 受體對SAP 導致的肺損傷進行探討。

材料與方法

1.材料:選用體重180 ～200g 的雄性SD 大鼠(SPF 級)，購于甘肅省中醫學院動物實驗中心;牛磺膽酸鈉購于美國Sigma 公司;CB2 受體激動劑HU-308 和CB2 受體抑制劑AM-630 購于美國Cayman 公司;IL -6 和TNF -αELISA 試劑盒購于美國R＆D 公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒購于南京建成生物公司。

2.方法:(1)SAP 模型的建立方法:大鼠禁食12h，禁水6h。腹腔注射2%的戊巴比妥(35mg/kg)麻醉大鼠后，仰臥位固定手術臺上，常規備皮、消毒、鋪巾，沿劍突下腹正中切口1.5cm，在肝門和十二指腸之間找到胰膽管，用動脈夾夾閉肝門端胰膽管。用與微量注射泵連接的4.5 號針頭經十二指腸壁外側壁穿刺，在十二指腸乳頭胰管開口處逆行刺入胰管約0.5cm，用動脈夾固定針頭。微量注射泵以0.2ml/min 速度注射注入4%牛磺膽酸鈉1.0ml/kg，注射完畢10min 后胰腺組織出現明顯的水腫伴出血壞死灶，提示動物模型已初步建立，退針去夾，復位腸管，逐層縫合腹壁。(2)分組:將96 只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為4 組:對照組(n =24)、SAP 組(n =24)、HU-308 組(n=24)、AM-630 組(n=24)。每組根據時間點分為3 個亞組:3h 組、6h 組、12h 組，每亞組中8 只大鼠。對照組:開腹后僅翻動胰腺組織后關腹;SAP 組:4%牛磺膽酸鈉建立SAP 模型;HU-308 組:腹腔注射HU-308 2.5mg/kg，1h 后建立SAP 模型;AM-630 組:腹腔注射AM-630 2.5mg/kg，1h 后建立SAP 模型。大鼠術后禁食，自由飲水。(3)取材及檢測:所有組大鼠在模型建立后，分別在3、6、12h 經頸動脈行動脈插管采血靜置30min 后3000r/min 離心15min，分離血清，血清置-80℃冰箱中低溫保存，采用ELISA 試劑盒檢測血清TNF-α 和IL -6 水平。取新鮮全肺組織，左肺下葉置于-80℃冰箱保存，勻漿后使用MPO 試劑盒和酶標儀在460nm處進行OD 值測定。右肺下葉組織浸于10%中性甲醛液中固定保存制作HE 病理切片，參考Hofbaue 等［13］的評分標準進行組織病理學評分。其余肺組織用濾紙吸干表面水分后稱重，置于70℃烘箱烘烤72h，測量濕干重之比。

結 果

1.血清TNF - α 的水平:在各個時間點，HU -308 組、SAP 組和AM-630 組中TNF-α 水平均顯著高于對照組水平(P ＜0. 05)，并具有時間依賴性。HU-308 組中TNF - α 水平在3 個時間點均低于SAP 組(P ＜0.05)，AM -630 組與SAP 組的比較中，在各個時間點AM -630 組中TNF - α 的水平高于SAP 組(P ＜0.05，表1)。

表1 血清TNF-α 水平(ng/ml)

2.血清IL -6 的水平:各時間點HU -308 組、SAP 組和AM-630 組中IL-6 水平均高于對照組(P＜0.05)。HU -308 組中的IL -6 水平均低于SAP組(P ＜0.05)，AM -630 組中的IL -6 水平均高于SAP 組(P ＜0.05，表2)。

表2 血清IL-6 水平(pg/ml)

3.肺組織濕干重之比:在各個時間點，HU -308組、SAP 組、AM-630 組肺組織濕干重之比均高于對照組(P ＜0.05)。HU -308 組、SAP 組、AM -630 組中比值的變化均隨時間的改變而增加(P ＜0.05)。在各個時間點，HU -308 組低于SAP 組(P ＜0.05)。在3h，AM-630 組比值高于SAP 組，但無統計學差異(P ＞0.05)，在6、12h，AM -630 組比值均高于SAP組，差異有統計學意義(P ＜0.05，表3)。

表3 肺組織的濕干重之比

4.肺組織髓過氧化物酶(MPO)水平的變化:HU-308 組、SAP 組和AM -630 組中MPO 水平隨時間的變化而增加，與對照組比較有統計學差異(P ＜0.05)。HU -308 組、SAP 組和AM -630 組中MPO水平均高于對照組水平(P ＜0.05)。在每個時間點，HU-308 組中的IL-6 水平均低于SAP 組水平(P ＜0.05)，AM-630 組中的MPO 水平均高于SAP 組(P＜0.05，表4)。

表4 肺組織MPO 水平的變化(U/g)

5.肺組織病理學評分:在光鏡下觀察，對照組肺臟組織結構基本正常，未見肺組織間質的水腫及壞死出血，肺泡間隔正常，肺泡內無中性粒細胞的浸潤。在3h 時間點，SAP 組肺組織間質出現水腫，肺泡的間隔明顯增寬，伴有大量中性粒細胞浸潤，有出血點和小部分的實變，結構出現破壞，HU -308 組較SAP 組病理改變稍輕，而AM -630 組較SAP 組病理改變基本相似。在6、12h，HU-308 組、AM-630 組、SAP 組的病理損害程度逐漸增加，SAP 組肺組織結構損害更加突出，AM-630 組病理損害較SAP 組嚴重，出現壞死和出血，HU -308 組的病理表現雖然也有嚴重的改變，但較SAP 組表現輕(表5，圖1)。

表5 肺組織病理學評分

圖1 各組模型建立后12h 病理切片圖(HE，×100)

討 論

本實驗結果表明，CB2 受體介導SAP 肺組織損傷病理生理學過程。激活CB2 受體能夠抑制肺損傷的形成和發展，抑制CB2 受體加重SAP 導致的肺損傷。

CB2 受體主要在B 細胞、T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等免疫細胞上表達［9］。CB2 受體可以激活多種細胞內信號轉導通路表現出抗炎和免疫抑制作用［12，14］。SAP 導致的SIRS 是MODS 發生、發展的主要因素，控制炎癥發展是預防及治療MODS 的重要措施。目前的研究表明CB2 受體激活后能抑制結腸炎、膿毒癥等炎性疾病發展［15，16］。但CB2 受體在SAP 中產生的作用目前未見文獻報道，本課題主要目的是探討CB2 受體在SAP 導致的肺損傷中產生的作用。

本研究表明，CB2 受體激動劑HU -308 顯著降低血清TNF-α 和IL -6 水平，相反，CB2 受體抑制劑AM-630 則顯著升高血清中TNF -α 和IL -6 的水平，這提示CB2 受體激活能顯著抑制早期SAP 病理生理學過程。TNF -α 和IL -6 是SAP 早期胰酶及壞死物質刺激免疫細胞分泌的促炎因子，在肺損傷中TNF-α 和IL-6 主要起到了損傷內皮細胞、聚集中性粒細胞并激活釋放氧自由基的作用［2］。減少血清中TNF -α 和IL -6 的水平在肺損傷的治療中有著非常重要的意義。在膿毒癥和免疫細胞的研究中提示，激活CB2 受體能下調免疫細胞中NF -κB 的mRNA 表達和破壞免疫細胞的抗原遞呈過程［17］。在SAP 的發展過程中，壞死物質和胰酶的抗原遞呈是SAP 激活免疫系統的始動環節，免疫細胞中NF -κB的mRNA 同樣會過度表達，NF-κB 可以啟動TNF -α 和IL-6 的mRNA 表達［18］。被激活的CB2 受體可能從SAP 的始動環節破壞了免疫細胞的抗原遞呈過程，在基因表達方面可能下調了免疫細胞中NF -κB的mRNA 表達，最終使SAP 早期免疫應答減弱和促炎因子減少。

本研究結果還表明，CB2 受體激動劑HU -308顯著降低SAP 模型中肺組織內的MPO 水平，相反，CB2 受體抑制劑AM-630 則升高了MPO 水平，提示CB2 受體激動減少中性粒細胞在肺組織內的聚集和MPO 的釋放。同時，本研究結果還提示，肺組織內MPO 水平的變化與血清中TNF -α 和IL -6 的水平變化呈正相關。HU -308 組的血清中TNF -α 和IL-6 水平的降低，使中性粒細胞在肺內聚集減少、激活減弱及釋放MPO 的能力降低，從而減輕肺臟損傷。而AM-630 組的血清中TNF -α 和IL -6 的水平增高則會使中性粒細胞在肺內聚集增加、激活增強及釋放MPO 的能力升高，從而加重肺損傷。除此之外，由于CB2 受體主要分布于中性粒細胞上，CB2 受體是否直接作用于中性粒細胞，作用方式及其作用機制也未明確。在CB2 受體對免疫系統的作用研究中，CB2受體在免疫細胞上的作用方式及機制將是一個非常重要的研究部分。

肺組織的濕干重之比主要反應了肺毛細血管的通透性。病理圖像及評分是對肺損傷程度的直接評價。在本次實驗中，肺組織的濕干重之比及病理圖像評分也與TNF-α、IL-6、MPO 水平呈正相關。這也說明了TNF-α、IL-6 及MPO 水平是導致肺損傷的重要因素。肺毛細血管的通透性增加及病理損害是SAP 在肺臟損害中最終的結果。從本次實驗結果可以得出，CB2 受體的激活降低了肺損傷程度，CB2 受體的抑制則加重了肺損傷程度。

1 ?urbatovi'c M，Jovanovi'c K，Radakovi'c S，et al. Pathophysiological aspects of severe acute pancreatitis-associated lung injury［J］. Srpski Arhivza Celokupno Lekarstvo，2005，133(1 -2):76 -81

2 王彬，張曉華. 細胞因子在重癥急性胰腺炎合并急性肺損傷中的作用［J］. 醫學研究生學報，2012，25(11):1208 -1212

3 程石，宋茂民，何三光. 腫瘤壞死因子—α 對大鼠壞死性胰腺炎肺損傷的影響［J］.中華實驗外科雜志，2004，20(7):593 -594

4 Quartilho A，Mata HP，Ibrahim MM，et al. Inhibition of inflammatory hyperalgesia by activation of peripheral CB2 cannabinoid receptors［J］.Anesthesiology，2003，99(4):955 -960

5 Després JP，Golay A，Sj?str?m L. Effects of rimonabant on metabolic risk factors in overweight patients with dyslipidemia［J］. New England Journal of Medicine，2005，353(20):2121 -2134

6 Mavromoustakos T，Yang D，Theodoropoulou E，et al. Studies of the conformational properties of the cannabimimetic aminoalkylindole pravadoline using NMR and molecular modeling［J］. European Journal of Medicinal Chemistry，1995，30(3):227 -234

7 Petrocellis LD，Cascio MG，Marzo VD. The endocannabinoid system:a general view and latest additions［J］. British Journal of Pharmacology，2004，141(5):765 -774

8 Atwood BK，Straiker A，Mackie K. CB2:Therapeutic target - in -waiting［J］. Progress in Neuro - Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2012，38(1):16 -20

9 Galiègue S，Mary S，Marchand J，et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations［J］.European Journal of Biochemistry，1995，232(1):54 -61

10 Carayon P，Marchand J，Dussossoy D，et al. Modulation and functional involvement of CB2 peripheral cannabinoid receptors during Bcell differentiation［J］.Blood，1998，92(10):3605 -3615

11 李素燕，顏玲娣，宮澤輝. 大麻CB2 受體在中樞神經系統的分布及其激動劑的藥理作用［J］. 中國藥理學通報，2009，25(1):5 -8

12 Klein TW. Cannabinoid - based drugs as anti - inflammatory therapeutics［J］.Nature Reviews Immunology，2005，5(5):400 -411

13 Hofbauer B，Saluja AK，Bhatia M，et al. Effect of recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase on two models of experimental acute pancreatitis［J］.Gastroenterology，1998，115(5):1238 -1247

14 李晶，王馨，龍云，等. 大麻CB2 受體分子生物學信號及信號傳導機制［J］.中外醫療，2011，30(30):191 -192

15 Storr MA，Keenan CM，Zhang H，et al. Activation of the cannabinoid 2 receptor (CB2)protects against experimental colitis［J］.Inflammatory Bowel Diseases，2009，15(11):1678 -1685

16 Tschfip J，Kasten KR，Nogueiras R，et al. The cannabinoid receptor 2 is critical for the host response to sepsis［J］. Journal of Immunology，2009，183(1):499 -505

17 Csóka B，Németh ZH，Mukhopadhyay P，et al. CB2 cannabinoid receptors contribute to bacterial invasion and mortality in polymicrobial sepsis［J］.PLoS One，2009，4(7):e6409

18 吳鑫，趙國海. 炎性介質與重癥急性胰腺炎肺損傷［J］. 醫學綜述，2010，16(17):2607 -2611